生物化学与分子生物学/DNA实验技术/动物基因组DNA的提取

实验原理 编辑

在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于L嘴菌体构建基因组文库和 Southern分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

仪器、材料与试剂 编辑

仪器 编辑

  1. 台式离心机
  2. 玻璃匀浆器
  3. 高压灭菌锅
  4. 恒温水浴

材料 编辑

  1. 1.5mL微量离心管
  2. 微量取样器和吸头
  3. 无菌过滤器(一次性)
  4. 10 mL注射器
  5. 鼠肝
  6. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)
  7. 十二烷基硫酸钠(SDS)
  8. 乙二胺四乙酸(EDTA)
  9. 蛋白酶K
  10. RNA酶
  11. DNA相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

试剂 编辑

1.5 mol/L NaCl
0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0
0.5 mol/L EDTA pH8.0
3 mol/L NaAc pH5.2
以上均高压灭菌。
蛋白酶K 10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20℃保存
组织匀浆液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0)
酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS
无DNA酵的RNA酶 将胰RNA酶溶解于10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L  NaCl溶液中,浓度l0mg/mL,于100℃水浴处理15min,以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存
TE缓冲液 10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)
平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1 (体积比) 氧仿,异戊醇=24:1 (体积比)
5xTBE 5.4gTris,2.75g硼酸  2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL;
6x上样缓冲液 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液
λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP) 21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

实验步骤 编辑

本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下降。整个操作过程中,应尽量避免DNA酶的污染,特g4注童动作温和,减少对DNA的机械捌伤。

  1. 取0.2g鼠肝,用冰冷的生理盐水洗3次,然后置于2.0mL匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。
  2. 将组织细胞移至1.5ml离心管中,50000rpm离心30-60sec,(尽可能在低温下操作),弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入1倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
  3. 沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散,分两管,再加0.4mL酵解液,翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h;
  4. 沉淀加RNase至终浓度200µg/mL,37℃水浴1 h;
  5. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心;
  6. 有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、
  7. 10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复1.6操作)。
  8. 用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心混匀(要充分),再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20  过夜。
  9. 12 000rpm离心19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm离心15min室握温干燥(不要大干,否则DNA不易溶解),加入适量TE缓冲液,存放于4℃,轻摇溶解过夜,即可得 到实验动物基因组DNA。
  10. 电泳鉴定DNA,由于基因组DNA相对分子质量较大,用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,先在底部锦一层1%的支持胶,凝固后再铺上一层0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾到的支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准),观察基因组DNA大小,用溴化乙锭染色观察结果。

注意事项 编辑

  1. 操作过程尽量在低温下进行,避免DNA降解。
  2. 琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。
  3. 提取得到的基因组DNA应为单一条带,DNA降解可形成弥散带型。