生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/動物基因組DNA的提取

實驗原理

在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚抽提，可以得到哺乳動構基因組DNA，用此方法得到的DNA長度為100-150 kb，適用於L嘴菌體構建基因組文庫和 Southern分析。

通過本實驗了解並掌握提取基因組DNA的原理和步驟，以及相對分子質量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術。

儀器、材料與試劑

儀器

1. 台式離心機
2. 玻璃勻漿器
3. 高壓滅菌鍋
4. 恆溫水浴

材料

1. 1.5mL微量離心管
2. 微量取樣器和吸頭
3. 無菌過濾器(一次性)
4. 10 mL注射器
5. 鼠肝
6. 三羥甲基氨基甲烷(Tris)
7. 十二烷基硫酸鈉(SDS)
8. 乙二胺四乙酸(EDTA)
9. 蛋白酶K
10. RNA酶
11. DNA相對分子質量標準物，DNA／EcoRI+HindⅢ相對分子質量標準物

試劑

1.5 mol／L NaCl
0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0
0.5 mol／L EDTA pH8.0
3 mol／L NaAc pH5.2
以上均高壓滅菌。
蛋白酶K	10mg／mL配好後用一次性過濾器過濾，-20℃保存
組織勻漿液	100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)
酶解液	200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS
無DNA酵的RNA酶	將胰RNA酶溶解於10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol／L  NaCl溶液中，濃度l0mg／mL，於100℃水浴處理15min，以降解DNA酶，緩慢冷卻到室溫，-20℃保存
TE緩衝液	10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)
平衡酚(pH8.0)：氧仿：異戊醇=25:24:1 (體積比)	氧仿，異戊醇=24:1 (體積比)
5xTBE	5.4gTris，2.75g硼酸  2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；
6x上樣緩衝液	0.25％溴酚藍，40％(W／V)蔗糖水溶液
λDNA／EcoRI+／HindⅢ 相對分於質量標準物片段(bP)	21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

實驗步驟

本實驗在無液氮的條件下，鍘備鼠肝DNA，與有液氮條件下相比，產量和質量都有所下降。整個操作過程中，應儘量避免DNA酶的污染，特g4注童動作溫和，減少對DNA的機械捌傷。

1. 取0.2g鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然後置於2.0mL勻漿掖中，用玻璃勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作，切匆將細胞破碎，可鏡檢觀察)。
2. 將組織細胞移至1.5ml離心管中，50000rpm離心30-60sec，(儘可能在低溫下操作)，棄上清，若沉澱中血細胞較多，可再加入1倍於細胞體積的勻漿液洗一次。
3. 沉澱加0.8mL無菌水迅速吹散，分兩管，再加0.4mL酵解液，翻轉混勻(動作一定要輕)55℃水浴處理12-18 h；
4. 沉澱加RNase至終濃度200µg／mL，37℃水浴1 h；
5. 加入等體積酚／氯仿／異戊醇抽提一次，(慢慢旋轉混勾，傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、10min、10000rpm離心；
6. 有時如果DNA含量過高，水相在下層，實驗時應注意觀察。用擴口吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉澱)，加等體積氧仿／異戊醇，4℃、
7. 10 000rrpm離心10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重複1．6操作)。
8. 用擴口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)，再向每管中加入2.5倍體積的無水乙醇，-20  過夜。
9. 12 000rpm離心19min，棄上清，75％冷乙醇洗滌一次，12000rpm離心15min室握溫乾燥(不要大干，否則DNA不易溶解)，加入適量TE緩衝液，存放於4℃，輕搖溶解過夜，即可得 到實驗動物基因組DNA。
10. 電泳鑑定DNA，由於基因組DNA相對分子質量較大，用0.3％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定，先在底部錦一層1％的支持膠，凝固後再鋪上一層0.3％瓊脂糖凝膠，插上梳子(枚子不能瑾到的支持膠)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上樣緩衝液和35µl無菌水混勻後小心上樣(可在另一孔加DNA相對分於質量標準)，觀察基因組DNA大小，用溴化乙錠染色觀察結果。

注意事項

1. 操作過程儘量在低溫下進行，避免DNA降解。
2. 瓊脂糖凝膠脆弱，應小心操作。
3. 提取得到的基因組DNA應為單一條帶，DNA降解可形成彌散帶型。