細胞生物學/細胞工程的應用

細胞工程 - 細胞工程的主要相關技術 - 細胞工程的應用
藉助細胞工程技術可對細胞的遺傳表型進行定向改造並獲得新型細胞，以至新的個體。因此，無論是細胞本身或是細胞的產物在醫學實踐中均具有廣闊的應用領域，尤其是幹細胞的研究與技術的興起與發展，為治療入類某些以往難以治療的疾病開闢了前所未有的前景。

單株抗體的製備

自1975年G.Kohler和C. Milstein創建雜交瘤(hybr idoma)技術之後，單株抗體(monoclonal antibody)已成為科學研究和疾病診療中不可缺少的重要工具，它也成為細胞工程中卓有成效的支柱技術之一。
經典的單株抗體製備方法是藉助於聚二乙醇將不分泌抗體的骨髓瘤細胞與分泌抗體的B淋巴細胞進行融合，並通過HAT選擇培養基篩選得到雜交瘤細胞。雜交瘤細胞從雙方親代細胞中獲得遺傳信息，一方面可如同骨髓瘤細胞那樣無限生長，另一方面又如同B淋巴細胞那樣分泌抗體。由這種雜交瘤細胞產生的抗體稱為單株抗體，它是一種免疫球蛋白，可用ELISA等方法篩選雜交瘤細胞培養上清液中的抗體，並對陽性細胞進行亞克隆(sub-clone) , 確定它們產生抗體的特異性。由於這種抗體是針對單一表位(epitope), 因此它對於特定抗原具有高親和力和高特異性。單株抗體在生物醫學研究、臨床診斷和治療方面都得到了廣泛的應用，是近年來最為成功的生物技術藥物，現已上市73個抗體藥物。
在實踐中，人們多利用小鼠腹水和離體懸浮培養方法在體內(in vivo )或體外(invitro )大量製備單株抗體。雜交瘤細胞也可在多種中空纖維系統及攪拌罐生物反應器進行大規模懸浮培養。

藥用蛋白的生產

用生物工程技術生產的製劑通稱為生物製品，其中藥用蛋白是重要的類別，包括疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰質炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、B型肝炎病毒疫苗、疱疹病毒Ⅰ型及Ⅱ型疫苗、巨細胞病毒疫苗等）、細胞因子（凝血因子ⅤⅢ和ⅠⅩ、促紅細胞生成素、生長激素、IL-2、神經生長因子等）、免疫調節劑(α、β、γ干擾素）以及單株抗體等。常用的表達系統分為細菌、酵母、昆蟲以及哺乳動物細胞四大類。
就製備的方式而言，包括哺乳動物細胞生物反應器和動物生物反應器，其優點是投資少、污染少、工藝相對簡單，而且產品的特異性較高等。
哺乳動物細胞生物反應器（下稱生物反應器）是指在人工條件下，高密度大量培養動物細胞並生產有應用價值的細胞蛋白質產品的設備。本章第一節中所介紹的細胞培養系統均屬於生物反應器範疇。20世紀90年代初，美國宇航局的生物反應器(NASAbioreactor)即為一種旋轉培養系統，它以一定的速度轉動使得不會發生細胞沉降，並且細胞往往形成三維聚集體以增加產品的生成；當停止轉動時，細胞聚集物沉降，此時可收集細胞以及同時更換新鮮培養液。
以轉基因動物作為一種生物反應器來生產蛋白質最早由美國K.Gordon等人於1987年報導，他們以小鼠乳腺細胞表達組織型纖溶酶原激活因子(tPA)。2009年，美國GTC Biotherapeutics公司研製的世界上第一個利用轉基因山羊奶液生產的藥物一一重組人抗凝血酶皿(Atryn)上市，標誌著轉基因動物藥物真正邁入產業化時代。乳腺作為生物反應器具有許多優點：首先，動物乳腺是一個自我封閉的系統，乳腺細胞表達的蛋白質絕大部分隨乳汁分泌，不會進入機體的血液系統中，這樣便可以避免大量表達的外源型蛋白質干擾宿主動物的生理狀況以及可能造成的傷害；此外，不論是轉基因牛、綿羊、山羊、兔、或是豬等，它們乳汁的產量較高，而且源源不斷，因此，可以獲得較多的蛋白產品。除了乳腺之外，血液、尿液也常是收集蛋白產品的原始材料。

疾病的細胞治療

細胞治療是將體外培養的具有正常功能的細胞植入患者體內（或直接導入病變部位）以代償病變細胞（或細胞丟失）所喪失的功能。另外，也可採用基因工程技術，將所培養的細胞進行體外遺傳修飾，然後再將其導入體內，治療機體的疾病。

幹細胞治療

幹細胞是個體的生長發育、組織器官的結構和功能的動態平衡以及其損傷後再生修復等生命現象的細胞學基礎。正因為幹細胞具有這些特性，因此可以用來治療某些疾病，以替代機體內因細胞衰老退化、死亡或丟失所導致的功能障礙性疾病，即進行幹細胞治療。截至2016年12月，全球已批准13項幹細胞治療產品。通常，幹細胞的獲取、誘導分化以及在疾病治療中的應用稱之為幹細胞工程。
1、神經系統疾病 不少神經系統的疾病都涉及神經元的損傷或死亡。神經幹細胞移植為諸如此類的神經系統疾病的治療帶來了曙光。
帕金森病是大腦黑質(substantia nigra)多巴胺分泌性神經元退化所引起的一種疾病。黑質是中腦內一個很小的區域，它有協助控制運動的功能，該區的神經元一旦退化、死亡便不能再生。黑質細胞釋放神經遞質多巴胺(dopamine) , 多巴胺不足或缺如，患者便會出現運動障礙，即不隨意肌的顫搐及反覆的肌肉運動。神經幹細胞具有被誘導分化成為多巴胺神經元的潛能，將體外擴增的人神經幹細胞移植至帕金森病大鼠模型中，能在大鼠體內分化為成熟的多巴胺神經元，並可建立突觸連接，改善大鼠模型的帕金森病的症狀。帕金森病入接受人胚中腦組織移植已有十餘年的歷史，這也為幹細胞治療提供了研究與實踐的基礎。
2、心肌梗死 這是由冠狀動脈阻塞引起的心臟疾病。人胚胎幹細胞可被誘導形成胚胎樣體，然後自發或誘導生成心肌祖細胞，它們不但具有心肌特徵，而且當這些細胞聚集在一起時，它們可起始有規律的搏動，這為心肌梗死的治療提供了前提。此外，間充質幹細胞也可被誘導分化為心肌幹細胞。2011年7月，韓國FDA批准了FCB-Pharmicell公司的自體骨髓間充質幹細胞上市，可被誘導分化為心肌細胞，用於急性心肌梗死治療。
3、糖尿病 該病的特徵是機體不能分泌（或分泌不足）或不能（或有效）利用胰島素所導致。2001年美國科學家N. Lu melsky從小鼠胚胎幹細胞中獲得可分泌胰島素的細胞，將它們注入糖尿病小鼠的脾臟內，24小時後發現小鼠不僅可產生胰島素，血糖水平也恢復正常。以色列學者S. Assady證明人胚胎幹細胞也可誘導出分泌胰島素的細胞，這為糖尿病幹細胞移植治療提供了細胞源泉。此外，用異種細胞（如豬）進行移植的研究也在進行中。所以選擇豬，原因在於豬的生理、解剖結構與人有一定的相似性。豬胰島素與人胰島素結構也極相似。
4、腫瘤 對於多數腫瘤，目前臨床尚無有效治療手段。隨著幹細胞研究的不斷深入，幹細胞治療惡性腫瘤的研究也有了一定的進展。幹細胞通過自身多功能分化的特性對腫瘤進行直接殺傷，且幹細胞還能對已損傷的機體組織進行修復和治療，並可以主動修復免疫系統。目前，造血幹細胞移植現已成為根治惡性血液病（白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤）的有效手段。間充質幹細胞也是一種骨髓來源的具有多功能分化能力的細胞，間充質幹細胞移植是通過採集自體或供體的幹細胞，擴增培養後，再由多種途徑輸入患者體內。
5、其他疾病 幹細胞研究的逐步深入，可為其他疾病的細胞治療提供前景。事實上早在上個世紀由E. D. Thomus提出的骨髓移植其本質是幹細胞治療。如今骨髓移植可用於白血病外，也用於再生障礙性貧血以及某些血液遺傳性疾病的治療。腫瘤放療或化療後對造血系統的損傷也可用造血細胞移植的方法來重建及恢復其造血的功能。此外，體細胞治療角膜再生、用脂肪幹細胞治療消化道痰管、以幹細胞再生肺組織均已取得較好效果。

工程細胞的治療運用

工程細胞是指採用基因工程手段對體外培養的細胞進行遺傳修飾，並由此篩選出可以穩定高水平地表達外源基因的細胞系，進而將這些細胞進行體外擴增後植入患者體內或直接植入病變部位，從而達到治療效果。
2001年，A. Martinez-Serrano利用溫度敏感性Hi-B5永生化細胞建立了高效神經生長因子(NGF)分泌的細胞系。該細胞系含有神經生長因子基因的多個拷貝。將這種細胞移植至切斷穹隆的大鼠紋狀體及中隔後，仍能持續分泌神經生長因子，並使90%的膽鹼能神經元得到恢復。同時，移植的細胞也能很好地在宿主動物腦組織中存活，並且在結構上已完全整合於受體的腦組織中。此外發現所移植的工程細胞還能分化為神經膠質細胞，這項研究顯示工程細胞的基因治療在臨床應用的可能性。
工程細胞除了用於恢復神經元功能之外，癌症的工程細胞治療也是研究熱點之一。人們希冀將來源於幹細胞的，可殺傷癌細胞的特殊細胞鈾定到特定的癌細胞，從而直接將癌細胞殺傷；或是將修飾癌細胞的藥物，其中包括可引起癌細胞凋亡的因子，輸送至癌細胞，使癌細胞死亡。
由千幹細胞具有長期增殖的特性，因此是用千基因治療的良好細胞載體，該途徑即稱為千細胞／ 基因聯合治療(combined stem cell/ gene therapy)。在眾多的幹細胞中，骨髓間充質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)比較受到人們的青眯，認為它是一個較為理想的候選細胞。原因是間充質幹細胞具有較大範圍的跨系分化能力，此外，骨髓間充質幹細胞的來源、分離和培養都比較容易。例如，將血管內皮生長因子(VEGF)基因導入骨髓間充質幹細胞，再誘導其分化為心肌細胞後植入心肌梗死區。植入的細胞一方面可以替代死亡了的心肌細胞，同時由於VEGF的作用，可以刺激周圍血管的形成。這種將細胞治療與基因治療相結合起來的方法，為眾多疾病治療帶來新的前景。誠然，為了避免免疫排斥以及可能的潛在致病因素的影響，載體細胞最好是同一個體的，即用於遺傳修飾的細胞最好來源於病入本身。

組織工程

組織工程的概念是由R.Langer和J. Pavcanti於1987年提出和確定的，是指運用細胞生物學和工程學的原理，研究和開發能修復或改善損傷組織的形態和功能的生物替代物，將其填入機體，恢復失去或下降的功能。組織工程的基本原理和方法是將可體外擴增的正常組織和細胞吸附於一種生物相容性良好的、可被機體吸收的生物材料上，從而形成具有三維空間結構的複合體；然後將細胞-生物材料複合體植入機體器官的病損部位，替代受損的器官。細胞在生物材料被機體逐漸吸收的過程中形成了新的具有相應形態結構和功能的器官或組織，恢復器官或組織的功能或部分功能，從而達到修復創傷或是重建的目的。組織工程的主要研究內容包括如下幾個方面：①種子細胞的性質；②細胞外基質(extracellular matrix, ECM)替代物的研製與開發；③組織工程化組織(tissue engineered tissue)對各種病損組織替代的研究。其中關鍵問題是植入組織細胞多大程度可恢復或代償機體失去的功能以及是否有免疫排斥等問題。

組織工程皮膚

組織工程皮膚可分為三大類型：表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。表皮替代物由生長在可降解基質或聚合物膜片上的表皮細胞組成，所謂活性繃帶(living bandage)即是此類工程皮膚；真皮替代物是含有細胞或不含細胞的基質結構，用來誘導成纖維細胞的遷移、增殖和分泌細胞外基質；全皮替代物包含以上兩種成分，既有表皮又有真皮結構。一般認為，利用表皮於細胞或者混合有表皮幹細胞的細胞所構建的真皮可以保持著自我更新能力，有利於皮膚的修復與維持；另外還可以形成較厚的表皮層，恢復皮膚對機體的保護功能。

組織工程腎臟

隨著組織工程技術的發展和臨床腎臟疾病晚期患者腎臟新供源的迫切需求，組織工程腎臟全器官培養的研究日益深入。Ross等利用組織工程技術，將大鼠腎細胞外基質和胚胎幹細胞通過受鼠腎動脈和輸尿管輸注，結果發現在受鼠的腎小球，血管和腎小管等處均檢測到供者胚胎幹細胞源的組織特異性分化細胞。目前，已經可以製備帶有天然細胞外基質的無細胞支架及再種植非人靈長類供腎細胞的組織工程腎臟。

組織工程骨和軟骨

骨組織工程多用BMMSC作為種子細胞，通過培養過程中加地塞米松、維生素C或β-甘油磷酸鈉等誘導為成骨樣細胞，並用骨鈣素、鈣結節形成、鹼性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白等來鑑定。將這種細胞按工程程序培養即可形成組織工程骨。此外，也可將BMMSC直接注入靶組織，它在局部微環境(niche)發生轉分化，形成骨或軟骨。人MSC的培養基中加入一定量的轉鐵蛋白、丙酮酸、胰島素、地塞米松、轉化生長因子等，則MSC可分化成為呈Ⅱ型膠原陽性的軟骨細胞。

人工工程血管

將內皮細胞和平滑肌細胞聯合種植於多孔三維的多聚L-乳酸支架上，可形成血管。也有學者用成肌細胞(myoblasts)、胚胎成纖維細胞以及內皮細胞聯合種植於多聚L-乳酸(PLLA)和多聚乳酸-甘醇酸(PLGA)構成的可降解網格支架上，觀察到血管的形成。工程血管的形成將為器官移植的血液供應提供了前提條件。

組織工程心臟瓣膜

目前對於組織工程心臟瓣膜的研究非常活躍。其製備方法多樣，主要包括：①在體外將細胞種植於生物降解的支架上並在生物反應器內發育成熟形成組織；②將細胞種植在天然生物降解的支架上；③通過植入降解組織引導組織再生，即由內源性細胞重塑組織；④植入脫細胞瓣膜材料；⑤利用內源性病理生理過程在體內生成組織。經典的組織工程模式包括：構建細胞（包括分化不同階段的幹細胞）和細胞賴以生長的支架，然後將細胞/支架複合物放入生物反應器孵育以構建組織，將體外構建的組織植入體內後即發生組織生長和重塑。此間發生的主要病理生理過程有：①細胞增殖和遷移；②細胞外基質的生成和組織生長；③支架降解；④組織重塑。體內組織工程瓣膜包含植入的細胞和（或）受者源的新細胞。

其他工程器官

迄今組織工程角膜己比較成熟，其他組織或器官由於體積大、組成細胞多以及功能複雜等因素在實施中還存在一定困難，但已有組織工程膀胱、肝臟、小腸、食管等的報導。隨著對種子細胞及其分化潛能以及支架基質等方面的研究進展，組織工程器官的名單無疑會越來越寬，將對人類目前尚無法治療的疾病帶來光明前景。