细胞生物学/细胞工程的应用

细胞工程 - 细胞工程的主要相关技术 - 细胞工程的应用
借助细胞工程技术可对细胞的遗传表型进行定向改造并获得新型细胞，以至新的个体。因此，无论是细胞本身或是细胞的产物在医学实践中均具有广阔的应用领域，尤其是干细胞的研究与技术的兴起与发展，为治疗入类某些以往难以治疗的疾病开辟了前所未有的前景。

单克隆抗体的制备

自1975年G.Kohler和C. Milstein创建杂交瘤(hybr idoma)技术之后，单克隆抗体(monoclonal antibody)已成为科学研究和疾病诊疗中不可缺少的重要工具，它也成为细胞工程中卓有成效的支柱技术之一。
经典的单克隆抗体制备方法是借助于聚二乙醇将不分泌抗体的骨髓瘤细胞与分泌抗体的B淋巴细胞进行融合，并通过HAT选择培养基筛选得到杂交瘤细胞。杂交瘤细胞从双方亲代细胞中获得遗传信息，一方面可如同骨髓瘤细胞那样无限生长，另一方面又如同B淋巴细胞那样分泌抗体。由这种杂交瘤细胞产生的抗体称为单克隆抗体，它是一种免疫球蛋白，可用ELISA等方法筛选杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，并对阳性细胞进行亚克隆(sub-clone) , 确定它们产生抗体的特异性。由于这种抗体是针对单一表位(epitope), 因此它对于特定抗原具有高亲和力和高特异性。单克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗方面都得到了广泛的应用，是近年来最为成功的生物技术药物，现已上市73个抗体药物。
在实践中，人们多利用小鼠腹水和离体悬浮培养方法在体内(in vivo )或体外(invitro )大量制备单克隆抗体。杂交瘤细胞也可在多种中空纤维系统及搅拌罐生物反应器进行大规模悬浮培养。

药用蛋白的生产

用生物工程技术生产的制剂通称为生物制品，其中药用蛋白是重要的类别，包括疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、疱疹病毒Ⅰ型及Ⅱ型疫苗、巨细胞病毒疫苗等）、细胞因子（凝血因子ⅤⅢ和ⅠⅩ、促红细胞生成素、生长激素、IL-2、神经生长因子等）、免疫调节剂(α、β、γ干扰素）以及单克隆抗体等。常用的表达系统分为细菌、酵母、昆虫以及哺乳动物细胞四大类。
就制备的方式而言，包括哺乳动物细胞生物反应器和动物生物反应器，其优点是投资少、污染少、工艺相对简单，而且产品的特异性较高等。
哺乳动物细胞生物反应器（下称生物反应器）是指在人工条件下，高密度大量培养动物细胞并生产有应用价值的细胞蛋白质产品的设备。本章第一节中所介绍的细胞培养系统均属于生物反应器范畴。20世纪90年代初，美国宇航局的生物反应器(NASAbioreactor)即为一种旋转培养系统，它以一定的速度转动使得不会发生细胞沉降，并且细胞往往形成三维聚集体以增加产品的生成；当停止转动时，细胞聚集物沉降，此时可收集细胞以及同时更换新鲜培养液。
以转基因动物作为一种生物反应器来生产蛋白质最早由美国K.Gordon等人于1987年报道，他们以小鼠乳腺细胞表达组织型纤溶酶原激活因子(tPA)。2009年，美国GTC Biotherapeutics公司研制的世界上第一个利用转基因山羊奶液生产的药物一一重组人抗凝血酶皿(Atryn)上市，标志着转基因动物药物真正迈入产业化时代。乳腺作为生物反应器具有许多优点：首先，动物乳腺是一个自我封闭的系统，乳腺细胞表达的蛋白质绝大部分随乳汁分泌，不会进入机体的血液系统中，这样便可以避免大量表达的外源型蛋白质干扰宿主动物的生理状况以及可能造成的伤害；此外，不论是转基因牛、绵羊、山羊、兔、或是猪等，它们乳汁的产量较高，而且源源不断，因此，可以获得较多的蛋白产品。除了乳腺之外，血液、尿液也常是收集蛋白产品的原始材料。

疾病的细胞治疗

细胞治疗是将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者体内（或直接导入病变部位）以代偿病变细胞（或细胞丢失）所丧失的功能。另外，也可采用基因工程技术，将所培养的细胞进行体外遗传修饰，然后再将其导入体内，治疗机体的疾病。

干细胞治疗

干细胞是个体的生长发育、组织器官的结构和功能的动态平衡以及其损伤后再生修复等生命现象的细胞学基础。正因为干细胞具有这些特性，因此可以用来治疗某些疾病，以替代机体内因细胞衰老退化、死亡或丢失所导致的功能障碍性疾病，即进行干细胞治疗。截至2016年12月，全球已批准13项干细胞治疗产品。通常，干细胞的获取、诱导分化以及在疾病治疗中的应用称之为干细胞工程。
1、神经系统疾病 不少神经系统的疾病都涉及神经元的损伤或死亡。神经干细胞移植为诸如此类的神经系统疾病的治疗带来了曙光。
帕金森病是大脑黑质(substantia nigra)多巴胺分泌性神经元退化所引起的一种疾病。黑质是中脑内一个很小的区域，它有协助控制运动的功能，该区的神经元一旦退化、死亡便不能再生。黑质细胞释放神经递质多巴胺(dopamine) , 多巴胺不足或缺如，患者便会出现运动障碍，即不随意肌的颤搐及反复的肌肉运动。神经干细胞具有被诱导分化成为多巴胺神经元的潜能，将体外扩增的人神经干细胞移植至帕金森病大鼠模型中，能在大鼠体内分化为成熟的多巴胺神经元，并可建立突触连接，改善大鼠模型的帕金森病的症状。帕金森病入接受人胚中脑组织移植已有十余年的历史，这也为干细胞治疗提供了研究与实践的基础。
2、心肌梗死 这是由冠状动脉阻塞引起的心脏疾病。人胚胎干细胞可被诱导形成胚胎样体，然后自发或诱导生成心肌祖细胞，它们不但具有心肌特征，而且当这些细胞聚集在一起时，它们可起始有规律的搏动，这为心肌梗死的治疗提供了前提。此外，间充质干细胞也可被诱导分化为心肌干细胞。2011年7月，韩国FDA批准了FCB-Pharmicell公司的自体骨髓间充质干细胞上市，可被诱导分化为心肌细胞，用于急性心肌梗死治疗。
3、糖尿病 该病的特征是机体不能分泌（或分泌不足）或不能（或有效）利用胰岛素所导致。2001年美国科学家N. Lu melsky从小鼠胚胎干细胞中获得可分泌胰岛素的细胞，将它们注入糖尿病小鼠的脾脏内，24小时后发现小鼠不仅可产生胰岛素，血糖水平也恢复正常。以色列学者S. Assady证明人胚胎干细胞也可诱导出分泌胰岛素的细胞，这为糖尿病干细胞移植治疗提供了细胞源泉。此外，用异种细胞（如猪）进行移植的研究也在进行中。所以选择猪，原因在于猪的生理、解剖结构与人有一定的相似性。猪胰岛素与人胰岛素结构也极相似。
4、肿瘤 对于多数肿瘤，目前临床尚无有效治疗手段。随着干细胞研究的不断深入，干细胞治疗恶性肿瘤的研究也有了一定的进展。干细胞通过自身多功能分化的特性对肿瘤进行直接杀伤，且干细胞还能对已损伤的机体组织进行修复和治疗，并可以主动修复免疫系统。目前，造血干细胞移植现已成为根治恶性血液病（白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤）的有效手段。间充质干细胞也是一种骨髓来源的具有多功能分化能力的细胞，间充质干细胞移植是通过采集自体或供体的干细胞，扩增培养后，再由多种途径输入患者体内。
5、其他疾病 干细胞研究的逐步深入，可为其他疾病的细胞治疗提供前景。事实上早在上个世纪由E. D. Thomus提出的骨髓移植其本质是干细胞治疗。如今骨髓移植可用于白血病外，也用于再生障碍性贫血以及某些血液遗传性疾病的治疗。肿瘤放疗或化疗后对造血系统的损伤也可用造血细胞移植的方法来重建及恢复其造血的功能。此外，体细胞治疗角膜再生、用脂肪干细胞治疗消化道痰管、以干细胞再生肺组织均已取得较好效果。

工程细胞的治疗运用

工程细胞是指采用基因工程手段对体外培养的细胞进行遗传修饰，并由此筛选出可以稳定高水平地表达外源基因的细胞系，进而将这些细胞进行体外扩增后植入患者体内或直接植入病变部位，从而达到治疗效果。
2001年，A. Martinez-Serrano利用温度敏感性Hi-B5永生化细胞建立了高效神经生长因子(NGF)分泌的细胞系。该细胞系含有神经生长因子基因的多个拷贝。将这种细胞移植至切断穹隆的大鼠纹状体及中隔后，仍能持续分泌神经生长因子，并使90%的胆碱能神经元得到恢复。同时，移植的细胞也能很好地在宿主动物脑组织中存活，并且在结构上已完全整合于受体的脑组织中。此外发现所移植的工程细胞还能分化为神经胶质细胞，这项研究显示工程细胞的基因治疗在临床应用的可能性。
工程细胞除了用于恢复神经元功能之外，癌症的工程细胞治疗也是研究热点之一。人们希冀将来源于干细胞的，可杀伤癌细胞的特殊细胞铀定到特定的癌细胞，从而直接将癌细胞杀伤；或是将修饰癌细胞的药物，其中包括可引起癌细胞凋亡的因子，输送至癌细胞，使癌细胞死亡。
由千干细胞具有长期增殖的特性，因此是用千基因治疗的良好细胞载体，该途径即称为千细胞／ 基因联合治疗(combined stem cell/ gene therapy)。在众多的干细胞中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)比较受到人们的青眯，认为它是一个较为理想的候选细胞。原因是间充质干细胞具有较大范围的跨系分化能力，此外，骨髓间充质干细胞的来源、分离和培养都比较容易。例如，将血管内皮生长因子(VEGF)基因导入骨髓间充质干细胞，再诱导其分化为心肌细胞后植入心肌梗死区。植入的细胞一方面可以替代死亡了的心肌细胞，同时由于VEGF的作用，可以刺激周围血管的形成。这种将细胞治疗与基因治疗相结合起来的方法，为众多疾病治疗带来新的前景。诚然，为了避免免疫排斥以及可能的潜在致病因素的影响，载体细胞最好是同一个体的，即用于遗传修饰的细胞最好来源于病入本身。

组织工程

组织工程的概念是由R.Langer和J. Pavcanti于1987年提出和确定的，是指运用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复或改善损伤组织的形态和功能的生物替代物，将其填入机体，恢复失去或下降的功能。组织工程的基本原理和方法是将可体外扩增的正常组织和细胞吸附于一种生物相容性良好的、可被机体吸收的生物材料上，从而形成具有三维空间结构的复合体；然后将细胞-生物材料复合体植入机体器官的病损部位，替代受损的器官。细胞在生物材料被机体逐渐吸收的过程中形成了新的具有相应形态结构和功能的器官或组织，恢复器官或组织的功能或部分功能，从而达到修复创伤或是重建的目的。组织工程的主要研究内容包括如下几个方面：①种子细胞的性质；②细胞外基质(extracellular matrix, ECM)替代物的研制与开发；③组织工程化组织(tissue engineered tissue)对各种病损组织替代的研究。其中关键问题是植入组织细胞多大程度可恢复或代偿机体失去的功能以及是否有免疫排斥等问题。

组织工程皮肤

组织工程皮肤可分为三大类型：表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成，所谓活性绷带(living bandage)即是此类工程皮肤；真皮替代物是含有细胞或不含细胞的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和分泌细胞外基质；全皮替代物包含以上两种成分，既有表皮又有真皮结构。一般认为，利用表皮于细胞或者混合有表皮干细胞的细胞所构建的真皮可以保持着自我更新能力，有利于皮肤的修复与维持；另外还可以形成较厚的表皮层，恢复皮肤对机体的保护功能。

组织工程肾脏

随着组织工程技术的发展和临床肾脏疾病晚期患者肾脏新供源的迫切需求，组织工程肾脏全器官培养的研究日益深入。Ross等利用组织工程技术，将大鼠肾细胞外基质和胚胎干细胞通过受鼠肾动脉和输尿管输注，结果发现在受鼠的肾小球，血管和肾小管等处均检测到供者胚胎干细胞源的组织特异性分化细胞。目前，已经可以制备带有天然细胞外基质的无细胞支架及再种植非人灵长类供肾细胞的组织工程肾脏。

组织工程骨和软骨

骨组织工程多用BMMSC作为种子细胞，通过培养过程中加地塞米松、维生素C或β-甘油磷酸钠等诱导为成骨样细胞，并用骨钙素、钙结节形成、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白等来鉴定。将这种细胞按工程程序培养即可形成组织工程骨。此外，也可将BMMSC直接注入靶组织，它在局部微环境(niche)发生转分化，形成骨或软骨。人MSC的培养基中加入一定量的转铁蛋白、丙酮酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子等，则MSC可分化成为呈Ⅱ型胶原阳性的软骨细胞。

人工工程血管

将内皮细胞和平滑肌细胞联合种植于多孔三维的多聚L-乳酸支架上，可形成血管。也有学者用成肌细胞(myoblasts)、胚胎成纤维细胞以及内皮细胞联合种植于多聚L-乳酸(PLLA)和多聚乳酸-甘醇酸(PLGA)构成的可降解网格支架上，观察到血管的形成。工程血管的形成将为器官移植的血液供应提供了前提条件。

组织工程心脏瓣膜

目前对于组织工程心脏瓣膜的研究非常活跃。其制备方法多样，主要包括：①在体外将细胞种植于生物降解的支架上并在生物反应器内发育成熟形成组织；②将细胞种植在天然生物降解的支架上；③通过植入降解组织引导组织再生，即由内源性细胞重塑组织；④植入脱细胞瓣膜材料；⑤利用内源性病理生理过程在体内生成组织。经典的组织工程模式包括：构建细胞（包括分化不同阶段的干细胞）和细胞赖以生长的支架，然后将细胞/支架复合物放入生物反应器孵育以构建组织，将体外构建的组织植入体内后即发生组织生长和重塑。此间发生的主要病理生理过程有：①细胞增殖和迁移；②细胞外基质的生成和组织生长；③支架降解；④组织重塑。体内组织工程瓣膜包含植入的细胞和（或）受者源的新细胞。

其他工程器官

迄今组织工程角膜己比较成熟，其他组织或器官由于体积大、组成细胞多以及功能复杂等因素在实施中还存在一定困难，但已有组织工程膀胱、肝脏、小肠、食管等的报道。随着对种子细胞及其分化潜能以及支架基质等方面的研究进展，组织工程器官的名单无疑会越来越宽，将对人类目前尚无法治疗的疾病带来光明前景。