生物化学与分子生物学/重组DNA技术

DNA重组和重组DNA技术 - 自然界的DNA重组和基因转移 - 重组DNA技术 - 重组DNA技术在医学中的应用
重组 DNA 技术又称分子克隆(molecular cloning) 、DNA 克隆 (DNA cloning) 或基因工程 (genetic engineering) , 是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上 DNA 分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新功能 DNA分子的方法，其主要过程包括：在体外将目的 DNA 片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组 DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一 DNA 分子的大量拷贝。在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽的制备以及基因结构的定向改造。自1972年成功构建第一个重组 DNA分子以来，重组 DNA 技术得到了快速发展，人们几乎可以随心所欲地分离、分析、切割－连接等操作基因。另外，该技术在生物制药、基因诊断、基因治疗等诸多方面都得到了广泛应用。

重组DNA技术中常用的工具酶

在重组 DNA 技术中，常需要一些工具酶用于基因的操作。例如，对目的 DNA (target DNA) 进行处理时，需利用序列特异性限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) , RE 在准确的位置切割DNA, 使较大的 DNA分子成为一定大小的 DNA 片段；构建重组 DNA分子时，必须在 DNA 连接酶催化下才能使 DNA 片段与载体共价连接。 此外，还有一些工具酶也是重组 DNA 时所必不可少的。

限制性核酸内切酶是最重要的工具酶

限制性核酸内切酶(RE)简称为限制性内切酶或限制酶，是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。除极少数RE来自绿藻外，绝大多数来自细菌，与相伴存在的 甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系(restriction modification system), RE对甲基化的自身DNA分 子不起作用，仅对外源DNA切割，因此对细菌遗传性状的稳定具有重要意义。

1. RE的分类及其特点 目前发现的RE有6000多种。根据RE的组成、所需因子及裂解DNA 方式的不同可分为三种类型，即I、II和III型。I型和III型酶为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰两种作用，且不在所识别的位点切割DNA(即特异性不强）；II型酶能在DNA双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀＂，对DNA进行精确切割。因此，重组DNA技术中所说的RE 通常指II型酶。
2. RE的命名原则RE的命名采用Smith和Nathane提出的属名与种名相结合的命名法，即第 一个字母是酶来源的细菌属名的首字母，用大写斜体；第二、三个字母是细菌菌种名的首字母，用小写斜体；第四个字母（有时无）表示细菌的特定菌株，用大写或小写；罗马数字表示RE在此菌种发现的 先后顺序。例如，EcoR I : E = Escherichia , 埃希菌属；co = coli, 大肠杆菌菌种；R = RY3, 菌株名；I , 为从此菌中第一个分离获得的RE。
3. RE识别及切割特异DNA序列 II型RE的识别位点通常为6或4个碱基序列，个别的RE识别8或8个以上碱基序列。大多数RE的识别序列为回文序列(palindrome)。回文结构是指在两条核苷酸链的特定位点，从5'→3'方向的序列完全一致。例如，EcoR I的识别序列，在两条链上的5'→3'序列均为GAAITC。
4. RE中的同尾酶 有些 RE 所识别的序列虽然不完全相同，但切割 DNA 双链后可产生相同的 单链末端（黏端），这样的酶彼此互称同尾酶 (isocaudarner), 所产生的相同黏端称为配伍末端(compatible end)。 例如，BamH Ⅰ (G'GATCC)和 Bgl II (A'GATCT)在切割不同序列后可产生相同的 5'黏端，即配伍末端(—GATC—)。配伍末端可共价连接，但连接后的序列通常就不能再被两个同尾酶中的任何一个酶识别和切割了。
5. RE中的同裂酶 有些 RE 虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或不同），这样的两种酶称同切点酶(isoschizomer) 或异源同工酶。例如，BamH I 和 Bst I 能识别并在相同位点切割同一 DNA 序列(G'GATCC)；Xma I 和 Sma I 虽能识别相同序列(GGGCCC),但切割位点不同，前者的切点在识别序列的第一个核苷酸后(G'GGCCC)，而后者的切点则在序列的中间(GGG'CCC)。同切点酶为 DNA 操作者增加了酶的选择余地。

重组DNA技术中常用的载体

载体(vector)是为携带目的外源 DNA 片段、实现外源 DNA 在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些 DNA 分子，按其功能可分为克隆载体和表达载体两大类，有的载体兼有克隆和表达两种功能。

克隆载体用于扩增克隆化 DNA 分子

克隆载体(cloning vector)是指用于外源 DNA 片段的克隆和在受体细胞中扩增的 DNA 分子，一般应具备的基本特点：①至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源 DNA 片段得到同步扩增；②至少有一个选择标志 (selection marker), 从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等；③有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。常用克隆载体主要有质粒、噬菌体 DNA 等。

1. 质粒克隆载体 质粒克隆载体是重组 DNA 技术中最常用的载体，可以是天然质粒，更多是人工改造的质粒。质粒是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状 DNA 分子，具备作为克隆载体的基本特点。例如，pUC18 质粒载体，具有一个复制起点 ori，一个选择标志—— 氨苄青霉素抗性基因 amp^R,多个单一酶切位点，也称多克隆酶切位点 (multiple cloning sites, MCS)。
2. 噬菌体DNA载体 λ和 M13 噬菌体 DNA 常用作克隆载体。稍早经入噬菌体 DNA 改造的载体系统有λgt系列（插入型载体，适用于 cDNA 克隆）和 EMBL 系列（置换型载体，适用于基因组 DNA 克隆）；经改造的 M13 载体有 M13mp 系列和 pUC 系列，它们是在M13 的基因间隔区插入了大肠埃希菌(E.coli)的一段调节基因及β-半乳糖苷酶 (LacZ)N-端 146 个氨基酸残基编码基因，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α片段。突变的 E.coli 宿主(lac^-)仅表达该酶的ω片段（酶的C-端）。单独存在β-半乳糖苷酶的α片段或ω片段都没有酶的活性，只有携带α片段基因的Ml3进入宿主细胞，宿主细胞才能同时表达α和ω片段，产生有活性的β-半乳糖苷酶，使特异性底物变为蓝色化合物，这就是所谓的α互补 (α complementation)。当外源基因的插入位点设计在 LacZ 基因内部时，外源基因的插入则会干扰 LacZ 的表达，利用 lacZ^-菌株为宿主细胞，在含 Lacz 底物 X-gal 和诱导剂 IPTG 的培养基上生长时会出现白色菌落；如果在 lacZ 基因内无外源基因插入，则有Lacz表达，转化菌在同样条件下呈蓝色菌落，这就是蓝白筛选。现在，很多质粒载体也构建了蓝白筛选系统。
3. 其他克隆载体 为增加克隆载体携带较长外源基因的能力，还设计有柯斯质粒(cosmid)载体（又称黏粒载体）、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)载体和酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)载体等。柯斯质粒是人工构建的含入DNA Cos序列和质粒复制子的特殊类型质粒载体，自身份子量一般只有5～7kb, 但能携带的外源DNA片段最大可达45kb。BAC是以大肠埃希菌性因子F质粒为基础构建的克隆载体，可携带的外源DNA片段在50～300kb 之间。YAC是含酵母染色体上必需的端粒、着丝点和复制起始序列的入工构建载体，能携带400kb左右的DNA片段。

表达载体能为外源基因提供表达元件

表达载体(expression vector)是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体，依据其宿主细胞的不同可分为原核表达载体(prokaryotic expression vector)和真核表达载体(eukaryotic expression vector) , 它们的区别主要在于为外源基因提供的表达元件。利用表达载体提供的表达元件也可在体外建立无细胞表达体系(cell-freeexpression system) , 根据表达载体上的表达元件决定提供原核细胞提取物或真核细胞提取物，其基本工作原理相同于在细胞内。下面简介原核表达载体和真核表达载体的结构特点。

1. 原核表达载体 该类载体用于在原核细胞中表达外源基因，由克隆载体发展而来，除了具有克隆载体的基本特征外，还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列，如启动子、核糖体结合位点即SD序列(Shine-Dalgarno sequence)、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体是E.coli表达载体。
2. 真核表达载体 该类载体用于在真核细胞中表达外源基因，也是由克隆载体发展而来的，除了具备克隆载体的基本特征外，所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。质粒真核表达载体一般具备的特点包括：①含有必不可少的原核序列，如复制起点、抗生素抗性基因、多克隆酶切位点(MCS)等，用于真核表达载体在细菌中复制及阳性克隆的筛选；②真核表达调控元件，如真核启动子、增强子、转录终止序列、poly(A)加尾信号等；③真核细胞复制起始序列，用于载体或基因表达框架在真核细胞中的复制；④真核细胞药物抗性基因，用于载体在真核细胞中的阳性筛选。根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体等。

重组DNA技术的基本原理及操作步骤

完整DNA克隆过程包括五大步骤：①目的DNA的分离获取（分）；②载体的选择与准备（选）；③目的DNA与载体的连接（连）；④重组DNA转入受体细胞（转）；⑤重组体的筛选及鉴定（筛）。

目的DNA的分离获取是DNA克隆的第一步

分离获取目的DNA的方法主要有以下几种：

1. 化学合成法 该方法可直接合成目的DNA片段，通常用于小分子肽类基因的合成，其前提是已知某基因的核苷酸序列，或能根据氨基酸序列推导出相应核苷酸序列。一般先合成两条完全互补的单链，经退火形成双链，然后克隆于载体。
2. 从基因组文库和cDNA文库中获取目的DNA 关于两种文库的构建和从文库中筛选目的DNA/cDNA的方法已经基本商业化了，可以根据具体需求从公司订购。
3. PCR法 PCR是一种高效特异的体外扩增DNA的方法。使用PCR法的前提是：已知待扩增目的基因或DNA片段两端的序列，并根据该序列合成适当引物。
4. 其他方法 除上述方法外，也可采用酵母单杂交系统克隆DNA结合蛋白的编码基因，或用酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白质的编码基因。

载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的

进行DNA克隆的目的主要有二：一是获取目的DNA片段，二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质。针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选择表达载体。另外，选择载体时还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素。除了上述需要考虑的因素外，选择载体时还需要注意载体内应有适宜的单一酶切位点或MCS,以便根据目的DNA片段，对载体进行适当的酶切处理。总之，在重组DNA技术中，载体的选择、准备和改进极富技术性，目的不同，操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。

目的DNA与载体连接形成重组DNA

依据目的DNA和线性化载体末端的特点，可采用不同的连接策略。主要连接策略如下：
1、黏端连接 依靠酶切后的黏性末端进行连接，不仅连接效率高，也具有方向性和准确性。 根据酶切策略不同可有以下几种黏端连接策略：

• 单一相同黏端连接：如果目的DNA序列两端和线性化载体两端为同一RE(或同切点酶，或同尾酶）切割所致，那么所产生的黏端完全相同。这种单一相同黏端连接时会有三种连接结果：载体自连（载体自身环化）、载体与目的DNA连接和DNA片段自连。可见，这种连接的缺点是：容易出现载体自身环化、目的DNA可以双向插入载体（即正向和反向插入）及多拷贝连接现象，从而给后续筛选增加了困难。采用碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，使之去磷酸化，可有效减少载体自身环化。 目的DNA如果反向插入载体，虽然不影响基因克隆，但却影响外源基因的表达。
• 不同黏端连接：如果用两种不同的RE分别切割载体和目的DNA, 则可使载体和目的 DNA的两端均形成两个不同的黏端，这样可以让外源DNA定向插入载体。这种使目的基因按特定方向插入载体的克隆方法称为定向克隆（direct cloning)。当然，定向克隆也可通过一端为平端，另一端为黏端的连接方法来实现。定向克隆可有效避免载体自连和DNA片段的反向插入和多拷贝现象。
• 通过其他措施产生黏端的连接：常用的在末端为平端的目的DNA片段制造黏端的方法有：①人工接头法：用化学合成法获得含RE位点的平端双链寡核苷酸接头(adaptor 或linker), 将此接头 连接在目的DNA的平端上，然后用相同的RE切割人工接头产生黏端，进而连接到载体上。②加同聚物尾法：用末端转移酶将某一核苷酸（如dC )逐一加到目的DNA的3'-端羟基上，形成同聚物尾（如同聚dC尾）；同时又将与之互补的另一核苷酸（如dG)加到载体DNA的3'-端羟基上，形成与目的DNA末端互补的同聚物尾（如同聚dG尾）。两个互补的同聚物尾均为黏端，因而可高效率地连接到一起。③PCR法：针对目的DNA的5'-端和3'-端设计一对特异引物，在每条引物的5'-端分别加上不同的RE位点，然后以目的DNA为模板，经PCR扩增便可得到带有引物序列的目的DNA, 再用相应RE切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。另外，在使用Taq DNA 聚合酶进行PCR时，扩增产物的3'-端一般多出一个不配对的腺苷酸残基(A)而成为黏端，这样的PCR产物可直接与3'-端带不配对的胸腺嘧啶残基(T)的线性化载体(T载体）连接，此即 T-A 克隆。
  

2、平端连接 若目的DNA两端和线性化载体两端均为平端，则两者之间也可在DNA连接酶的作用下进行连接，其连接结果有三种：载体自连、载体与目的DNA连接和DNA片段自连，但连接效率都较低。为了提高连接效率，可采用提高连接酶用量、延长连接时间、降低反应温度、增加DNA片段与载体的摩尔比等措施。平端连接同样存在载体自身环化、目的DNA双向插入和多拷贝现象等缺点。
3、黏-平端连接 黏-平末端连接是指目的DNA和载体通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。以该方式连接时，目的DNA被定向插入载体（定向克隆），连接效率介于黏端和平端连接之间。可采用提高平端连接效率的措施提高该方式的连接效率。

重组DNA转入受体细胞使其得以扩增

重组DNA转入宿主细胞后才能得到扩增。理想的宿主细胞通常是DNA/蛋白质降解系统和（或）重组酶缺陷株，这样的宿主细胞称为工程细胞。工程细胞具有较强的接纳外源DNA的能力，可保证外源DNA长期、稳定地遗传或表达。将重组DNA导入宿主细胞的常用方法有如下几种：

1. 转化 转化(transfor mation)是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，例如，重组质粒导入大肠埃希菌。然而，只有细胞膜通透性增加的细菌才容易接受外源DNA,这样的细菌称作感受态细胞(competent cells)。实现转化的方法包括化学诱导法（如氯化钙法）、电穿孔(electroporation)法等。此外，将质粒DNA直接导入酵母细胞以及将黏粒DNA导入细菌的过程也称作转化。
2. 转染 转染(transfection)是指将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程。常用的转染方法包括化学方法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等）和物理方法（如显微注射法、电穿孔法等）。此外，将噬菌体DNA直接导入受体细菌的过程也称作转染。
3. 感染 感染(infection)是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程。例如，以噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等DNA作为载体构建的重组DNA分子，经包装形成病毒颗粒后进入宿主细胞。

重组体的筛选与鉴定

重组DNA分子导入宿主细胞后，可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定，从而获得含重组DNA分子的宿主细胞。筛选和鉴定方法主要有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。
1、借助载体上的遗传标志进行筛选 载体上通常携带可供重组体筛选的遗传标志，如抗生素抗性基因等，据此可对含重组DNA的宿主细胞进行筛选。
(1)利用抗生素抗性标志筛选：将含有某种抗生素抗性基因的重组载体转化宿主细胞，然后在含相应抗生素的培养液中培养此细胞，若细胞能在这种条件下生长，则说明细胞中至少应含有导入的载体，但是否是插入目的DNA的载体，还需要进一步鉴定。若细胞中没有载体，则被抗生素杀死。
(2)利用基因的插入失活／插入表达特性筛选：针对某些带有抗生素抗性基因的载体，当目的DNA插入抗性基因后，可使该抗性基因失活。如果还以这种抗生素抗性进行筛选，不能生长的细胞应该是含重组DNA的细胞。以这种方式筛选时，通常载体上携带一个以上筛选标志基因。例如pBR322质粒含有氨茉青霉素抗性基因(amp^R)和四环素抗性基因(tet^R), 如将目的DNA插入tet^R中，tet^R失活，含重组DNA的细胞只能在含氨苯青霉素的培养基中生长，而不能在含四环素的培养基中生长。
(3)利用标志补救筛选：标志补救(marker rescue)是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷，从而在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选含有载体的宿主细胞。例如，S.cerevisiae酵母菌株，因trpl 基因突变而不能在缺少色氨酸的培养基上生长，当转入带有功能性trpl 基因的重组载体后，转化菌则能在色氨酸缺陷的培养基上生长。标志补救也可用于外源基因导入哺乳类细胞后阳性克隆的初筛，例如，当将带有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(dhfr)的真核表达载体导入dhfr 缺陷的哺乳类细胞后，则可使细胞在无胸腺嘧啶的培养基中存活，从而筛选出带有载体的克隆(DHFR可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，后者可用于合成胸腺嘧啶）。
(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选：λ噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对λDNA大小有严格要求，只有当λDNA的长度达到其野生型长度的75%～105%时，方能包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑，而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。根据此原理可初步筛出带有重组入噬菌体载体的克隆。
2、序列特异性筛选 根据序列特异性筛选的方法包括RE酶切法、PCR法、核酸杂交法、DNA测序法等。
(1) RE酶切法：针对初筛为阳性的克隆，提取其重组DNA, 以合适的RE进行酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳便可判断有无目的DNA片段的插入及插入片段的大小。同时，根据酶切位点在插入片段内部的不对称分布，还可鉴定插入DNA片段在载体上的方向；也可用多种RE制作并分析插入片段的酶切图谱。
(2) PCR法：利用序列特异性引物，经PCR扩增，可鉴定出含有目的DNA的阳性克隆。如果利用克隆位点两侧载体序列设计引物进行PCR扩增，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段的方向、序列和可读框的正确性。
(3)核酸杂交法：该方法可直接筛选和鉴定含有目的DNA的克隆。常用方法是菌落或噬斑原位杂交法：将转有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纤维素膜上，细菌裂解后所释放出的DNA将被吸附在膜上，将膜与标记的核酸探针杂交，通过检测探针的存在即可鉴定出含有重组DNA的克隆。根据核酸探针标记物的不同，可通过放射自显影、化学发光、 酶作用千底物显色等方法来显示探针的存在位置，也就是阳性克隆存在的位置。
(4)DNA测序法：该法是最准确的鉴定目的DNA的方法。针对已知序列，通过DNA测序可明确具体序列和可读框的正确性；针对未知DNA片段，可揭示其序列，为进一步研究提供依据。
3、亲和筛选法 亲和筛选法的前提是重组DNA进入宿主细胞后能够表达出其编码产物。 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法与上述菌落或噬斑核酸原位杂交相似，只是被检测的靶分子换成吸附于硝酸纤维素膜上的蛋白质，检测探针换成标记的抗体／抗原或配体／受体。

克隆基因的表达

采用重组DNA技术还可进行目的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的，这是基因工程的最终目标。基因表达涉及正确的基因转录、mRNA翻译、适当的转录后及翻译后的加工过程，这些过程对于不同的表达体系是不同的。克隆目的基因，进而大量地表达出有特殊意义的蛋白质，已成为重组DNA技术中一个专门的领域，这就是重组蛋白质表达。在蛋白质表达领域，表达体系的建立包括表达载体的构建、宿主细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。基因工程中的表达系统包括原核和真核表达体系。
1、原核表达体系 E.coli是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺。

• 原核表达载体的必备条件：运用E.coli的表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合下述标准：①含E.coli适宜的选择标志；②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子，如lac、tac启动 子或其他启动子序列；③含适当的翻译控制序列，如核糖体结合位点和翻译起始点等；④含有合理设计的MCS,以确保目的基因按一定方向与载体正确连接。
• 重组蛋白质的表达策略：在实际工作中，蛋白质表达策略颇不一致。有时表达目的是为了获得蛋白质抗原，以便制备抗体，此时要求表达的蛋白质或多肽具有抗原性，同时要求表达产物易于分 离、纯化。较好的策略是为目的基因连上一个编码标签肽的序列，从而表达为融合蛋白(fusion protein)。在有些情况下，表达的蛋白质多为不溶性的包含体(inclusion body) , 极易与细菌蛋白质分离。如果在设计融合基因时，在目的基因和标签序列之间加入适当的裂解位点，则很容易从表达的融合分子中去除标签序列。巧妙地设计标签序列还可大大方便表达产物的分离纯化。如果表达的蛋白质是为了用于生物化学、细胞生物学研究或临床诊断或基因防治，除分离纯化方便，更重要的是考虑蛋白质的功能和生物学活性。此时，表达可溶性蛋白质往往具有特异的生物学功能；如果表达的是包含体形式，还需要在分离纯化后进行复性或折叠。
• E.coli表达体系的缺点：E.coli表达体系在实际应用中尚存在一些不足之处，诸如：①由于缺乏转录后加工机制，对于真核基因来说，E.coli表达体系只能表达经逆转录合成的cDNA编码产物，不宜表达从基因组DNA上扩增的基因；②由于缺乏适当的翻译后加工机制，真核基因的表达产物在E.coli表达体系中往往不能被正确的折叠或糖基化修饰；③表达的蛋白质常常形成不溶性包含体，欲使其具有活性尚需进行复杂的变性-复性处理；④很难用 E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白质。

2、真核表达体系 真核表达体系除与原核表达体系有相似之处外，一般还常有自己的特点。真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly(A)加尾信号或染色体整合位点等。
真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳类细胞等，不仅可以表达克隆的cDNA,也可表达从真核基因组 DNA扩增的基因。哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当的修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。因此，采用真核表达体系的优势是：①具有转录后加工机制；②具有翻译后修饰机制；③表达的蛋白质不形成包含体（酵母除外）；④表达的蛋白质不易被降解。当然，操作技术难、费时、费钱是其缺点。