生物化學與分子生物學/重組DNA技術

DNA重組和重組DNA技術 - 自然界的DNA重組和基因轉移 - 重組DNA技術 - 重組DNA技術在醫學中的應用
重組 DNA 技術又稱分子克隆(molecular cloning) 、DNA 克隆 (DNA cloning) 或基因工程 (genetic engineering) , 是指通過體外操作將不同來源的兩個或兩個以上 DNA 分子重新組合，並在適當細胞中擴增形成新功能 DNA分子的方法，其主要過程包括：在體外將目的 DNA 片段與能自主複製的遺傳元件（又稱載體）連接，形成重組 DNA分子，進而在受體細胞中複製、擴增及克隆化，從而獲得單一 DNA 分子的大量拷貝。在克隆目的基因後，還可針對該基因進行表達產物蛋白質或多肽的製備以及基因結構的定向改造。自1972年成功構建第一個重組 DNA分子以來，重組 DNA 技術得到了快速發展，人們幾乎可以隨心所欲地分離、分析、切割－連接等操作基因。另外，該技術在生物製藥、基因診斷、基因治療等諸多方面都得到了廣泛應用。

重組DNA技術中常用的工具酶

在重組 DNA 技術中，常需要一些工具酶用於基因的操作。例如，對目的 DNA (target DNA) 進行處理時，需利用序列特異性限制性核酸內切酶 (restriction endonuclease, RE) , RE 在準確的位置切割DNA, 使較大的 DNA分子成為一定大小的 DNA 片段；構建重組 DNA分子時，必須在 DNA 連接酶催化下才能使 DNA 片段與載體共價連接。 此外，還有一些工具酶也是重組 DNA 時所必不可少的。

限制性核酸內切酶是最重要的工具酶

限制性核酸內切酶(RE)簡稱為限制性內切酶或限制酶，是一類核酸內切酶，能識別雙鏈DNA分子內部的特異序列並裂解磷酸二酯鍵。除極少數RE來自綠藻外，絕大多數來自細菌，與相伴存在的 甲基化酶共同構成細菌的限制-修飾體系(restriction modification system), RE對甲基化的自身DNA分 子不起作用，僅對外源DNA切割，因此對細菌遺傳性狀的穩定具有重要意義。

1. RE的分類及其特點 目前發現的RE有6000多種。根據RE的組成、所需因子及裂解DNA 方式的不同可分為三種類型，即I、II和III型。I型和III型酶為複合功能酶，同時具有限制和DNA修飾兩種作用，且不在所識別的位點切割DNA(即特異性不強）；II型酶能在DNA雙鏈內部的特異位點識別並切割，故其被廣泛用作「分子剪刀＂，對DNA進行精確切割。因此，重組DNA技術中所說的RE 通常指II型酶。
2. RE的命名原則RE的命名採用Smith和Nathane提出的屬名與種名相結合的命名法，即第 一個字母是酶來源的細菌屬名的首字母，用大寫斜體；第二、三個字母是細菌菌種名的首字母，用小寫斜體；第四個字母（有時無）表示細菌的特定菌株，用大寫或小寫；羅馬數字表示RE在此菌種發現的 先後順序。例如，EcoR I : E = Escherichia , 埃希菌屬；co = coli, 大腸桿菌菌種；R = RY3, 菌株名；I , 為從此菌中第一個分離獲得的RE。
3. RE識別及切割特異DNA序列 II型RE的識別位點通常為6或4個鹼基序列，個別的RE識別8或8個以上鹼基序列。大多數RE的識別序列為迴文序列(palindrome)。迴文結構是指在兩條核苷酸鏈的特定位點，從5'→3'方向的序列完全一致。例如，EcoR I的識別序列，在兩條鏈上的5'→3'序列均為GAAITC。
4. RE中的同尾酶 有些 RE 所識別的序列雖然不完全相同，但切割 DNA 雙鏈後可產生相同的 單鏈末端（黏端），這樣的酶彼此互稱同尾酶 (isocaudarner), 所產生的相同黏端稱為配伍末端(compatible end)。 例如，BamH Ⅰ (G'GATCC)和 Bgl II (A'GATCT)在切割不同序列後可產生相同的 5'黏端，即配伍末端(—GATC—)。配伍末端可共價連接，但連接後的序列通常就不能再被兩個同尾酶中的任何一個酶識別和切割了。
5. RE中的同裂酶 有些 RE 雖然來源不同，但能識別同一序列（切割位點可相同或不同），這樣的兩種酶稱同切點酶(isoschizomer) 或異源同工酶。例如，BamH I 和 Bst I 能識別並在相同位點切割同一 DNA 序列(G'GATCC)；Xma I 和 Sma I 雖能識別相同序列(GGGCCC),但切割位點不同，前者的切點在識別序列的第一個核苷酸後(G'GGCCC)，而後者的切點則在序列的中間(GGG'CCC)。同切點酶為 DNA 操作者增加了酶的選擇餘地。

重組DNA技術中常用的載體

載體(vector)是為攜帶目的外源 DNA 片段、實現外源 DNA 在受體細胞中無性繁殖或表達蛋白質所採用的一些 DNA 分子，按其功能可分為克隆載體和表達載體兩大類，有的載體兼有克隆和表達兩種功能。

克隆載體用於擴增克隆化 DNA 分子

克隆載體(cloning vector)是指用於外源 DNA 片段的克隆和在受體細胞中擴增的 DNA 分子，一般應具備的基本特點：①至少有一個複製起點使載體能在宿主細胞中自主複製，並能使克隆的外源 DNA 片段得到同步擴增；②至少有一個選擇標誌 (selection marker), 從而區分含有載體和不含有載體的細胞，如抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營養缺陷耐受基因等；③有適宜的RE單一切點，可供外源基因插入載體。常用克隆載體主要有質體、噬菌體 DNA 等。

1. 質體克隆載體 質體克隆載體是重組 DNA 技術中最常用的載體，可以是天然質體，更多是人工改造的質體。質體是細菌染色體外的、能自主複製和穩定遺傳的雙鏈環狀 DNA 分子，具備作為克隆載體的基本特點。例如，pUC18 質體載體，具有一個複製起點 ori，一個選擇標誌—— 氨苄青黴素抗性基因 amp^R,多個單一酶切位點，也稱多克隆酶切位點 (multiple cloning sites, MCS)。
2. 噬菌體DNA載體 λ和 M13 噬菌體 DNA 常用作克隆載體。稍早經入噬菌體 DNA 改造的載體系統有λgt系列（插入型載體，適用於 cDNA 克隆）和 EMBL 系列（置換型載體，適用於基因組 DNA 克隆）；經改造的 M13 載體有 M13mp 系列和 pUC 系列，它們是在M13 的基因間隔區插入了大腸埃希菌(E.coli)的一段調節基因及β-半乳糖苷酶 (LacZ)N-端 146 個胺基酸殘基編碼基因，其編碼產物為β-半乳糖苷酶的α片段。突變的 E.coli 宿主(lac^-)僅表達該酶的ω片段（酶的C-端）。單獨存在β-半乳糖苷酶的α片段或ω片段都沒有酶的活性，只有攜帶α片段基因的Ml3進入宿主細胞，宿主細胞才能同時表達α和ω片段，產生有活性的β-半乳糖苷酶，使特異性底物變為藍色化合物，這就是所謂的α互補 (α complementation)。當外源基因的插入位點設計在 LacZ 基因內部時，外源基因的插入則會干擾 LacZ 的表達，利用 lacZ^-菌株為宿主細胞，在含 Lacz 底物 X-gal 和誘導劑 IPTG 的培養基上生長時會出現白色菌落；如果在 lacZ 基因內無外源基因插入，則有Lacz表達，轉化菌在同樣條件下呈藍色菌落，這就是藍白篩選。現在，很多質體載體也構建了藍白篩選系統。
3. 其他克隆載體 為增加克隆載體攜帶較長外源基因的能力，還設計有柯斯質體(cosmid)載體（又稱黏粒載體）、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)載體和酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)載體等。柯斯質體是人工構建的含入DNA Cos序列和質體複製子的特殊類型質體載體，自身分子量一般只有5～7kb, 但能攜帶的外源DNA片段最大可達45kb。BAC是以大腸埃希菌性因子F質體為基礎構建的克隆載體，可攜帶的外源DNA片段在50～300kb 之間。YAC是含酵母染色體上必需的端粒、着絲點和複製起始序列的入工構建載體，能攜帶400kb左右的DNA片段。

表達載體能為外源基因提供表達元件

表達載體(expression vector)是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體，依據其宿主細胞的不同可分為原核表達載體(prokaryotic expression vector)和真核表達載體(eukaryotic expression vector) , 它們的區別主要在於為外源基因提供的表達元件。利用表達載體提供的表達元件也可在體外建立無細胞表達體系(cell-freeexpression system) , 根據表達載體上的表達元件決定提供原核細胞提取物或真核細胞提取物，其基本工作原理相同於在細胞內。下面簡介原核表達載體和真核表達載體的結構特點。

1. 原核表達載體 該類載體用於在原核細胞中表達外源基因，由克隆載體發展而來，除了具有克隆載體的基本特徵外，還有供外源基因有效轉錄和翻譯的原核表達調控序列，如啟動子、核糖體結合位點即SD序列(Shine-Dalgarno sequence)、轉錄終止序列等。目前應用最廣泛的原核表達載體是E.coli表達載體。
2. 真核表達載體 該類載體用於在真核細胞中表達外源基因，也是由克隆載體發展而來的，除了具備克隆載體的基本特徵外，所提供給外源基因的表達元件是來自真核細胞的。質體真核表達載體一般具備的特點包括：①含有必不可少的原核序列，如複製起點、抗生素抗性基因、多克隆酶切位點(MCS)等，用於真核表達載體在細菌中複製及陽性克隆的篩選；②真核表達調控元件，如真核啟動子、增強子、轉錄終止序列、poly(A)加尾信號等；③真核細胞複製起始序列，用於載體或基因表達框架在真核細胞中的複製；④真核細胞藥物抗性基因，用於載體在真核細胞中的陽性篩選。根據真核宿主細胞的不同，真核表達載體可分為酵母表達載體、昆蟲表達載體和哺乳類細胞表達載體等。

重組DNA技術的基本原理及操作步驟

完整DNA克隆過程包括五大步驟：①目的DNA的分離獲取（分）；②載體的選擇與準備（選）；③目的DNA與載體的連接（連）；④重組DNA轉入受體細胞（轉）；⑤重組體的篩選及鑑定（篩）。

目的DNA的分離獲取是DNA克隆的第一步

分離獲取目的DNA的方法主要有以下幾種：

1. 化學合成法 該方法可直接合成目的DNA片段，通常用於小分子肽類基因的合成，其前提是已知某基因的核苷酸序列，或能根據胺基酸序列推導出相應核苷酸序列。一般先合成兩條完全互補的單鏈，經退火形成雙鏈，然後克隆於載體。
2. 從基因組文庫和cDNA文庫中獲取目的DNA 關於兩種文庫的構建和從文庫中篩選目的DNA/cDNA的方法已經基本商業化了，可以根據具體需求從公司訂購。
3. PCR法 PCR是一種高效特異的體外擴增DNA的方法。使用PCR法的前提是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩端的序列，並根據該序列合成適當引物。
4. 其他方法 除上述方法外，也可採用酵母單雜交系統克隆DNA結合蛋白的編碼基因，或用酵母雙雜交系統克隆特異性相互作用蛋白質的編碼基因。

載體的選擇與準備是根據目的DNA片段決定的

進行DNA克隆的目的主要有二：一是獲取目的DNA片段，二是獲取目的DNA片段所編碼的蛋白質。針對第一種目的，通常選用克隆載體；針對第二種目的，需選擇表達載體。另外，選擇載體時還要考慮目的DNA的大小、受體細胞的種類和來源等因素。除了上述需要考慮的因素外，選擇載體時還需要注意載體內應有適宜的單一酶切位點或MCS,以便根據目的DNA片段，對載體進行適當的酶切處理。總之，在重組DNA技術中，載體的選擇、準備和改進極富技術性，目的不同，操作基因的性質不同載體的選擇和改建方法也不同。

目的DNA與載體連接形成重組DNA

依據目的DNA和線性化載體末端的特點，可採用不同的連接策略。主要連接策略如下：
1、黏端連接 依靠酶切後的黏性末端進行連接，不僅連接效率高，也具有方向性和準確性。 根據酶切策略不同可有以下幾種黏端連接策略：

• 單一相同黏端連接：如果目的DNA序列兩端和線性化載體兩端為同一RE(或同切點酶，或同尾酶）切割所致，那麼所產生的黏端完全相同。這種單一相同黏端連接時會有三種連接結果：載體自連（載體自身環化）、載體與目的DNA連接和DNA片段自連。可見，這種連接的缺點是：容易出現載體自身環化、目的DNA可以雙向插入載體（即正向和反向插入）及多拷貝連接現象，從而給後續篩選增加了困難。採用鹼性磷酸酶預處理線性化載體DNA，使之去磷酸化，可有效減少載體自身環化。 目的DNA如果反向插入載體，雖然不影響基因克隆，但卻影響外源基因的表達。
• 不同黏端連接：如果用兩種不同的RE分別切割載體和目的DNA, 則可使載體和目的 DNA的兩端均形成兩個不同的黏端，這樣可以讓外源DNA定向插入載體。這種使目的基因按特定方向插入載體的克隆方法稱為定向克隆（direct cloning)。當然，定向克隆也可通過一端為平端，另一端為黏端的連接方法來實現。定向克隆可有效避免載體自連和DNA片段的反向插入和多拷貝現象。
• 通過其他措施產生黏端的連接：常用的在末端為平端的目的DNA片段製造黏端的方法有：①人工接頭法：用化學合成法獲得含RE位點的平端雙鏈寡核苷酸接頭(adaptor 或linker), 將此接頭 連接在目的DNA的平端上，然後用相同的RE切割人工接頭產生黏端，進而連接到載體上。②加同聚物尾法：用末端轉移酶將某一核苷酸（如dC )逐一加到目的DNA的3'-端羥基上，形成同聚物尾（如同聚dC尾）；同時又將與之互補的另一核苷酸（如dG)加到載體DNA的3'-端羥基上，形成與目的DNA末端互補的同聚物尾（如同聚dG尾）。兩個互補的同聚物尾均為黏端，因而可高效率地連接到一起。③PCR法：針對目的DNA的5'-端和3'-端設計一對特異引物，在每條引物的5'-端分別加上不同的RE位點，然後以目的DNA為模板，經PCR擴增便可得到帶有引物序列的目的DNA, 再用相應RE切割PCR產物，產生黏端，隨後便可與帶有相同黏端的線性化載體進行有效連接。另外，在使用Taq DNA 聚合酶進行PCR時，擴增產物的3'-端一般多出一個不配對的腺苷酸殘基(A)而成為黏端，這樣的PCR產物可直接與3'-端帶不配對的胸腺嘧啶殘基(T)的線性化載體(T載體）連接，此即 T-A 克隆。
  

2、平端連接 若目的DNA兩端和線性化載體兩端均為平端，則兩者之間也可在DNA連接酶的作用下進行連接，其連接結果有三種：載體自連、載體與目的DNA連接和DNA片段自連，但連接效率都較低。為了提高連接效率，可採用提高連接酶用量、延長連接時間、降低反應溫度、增加DNA片段與載體的摩爾比等措施。平端連接同樣存在載體自身環化、目的DNA雙向插入和多拷貝現象等缺點。
3、黏-平端連接 黏-平末端連接是指目的DNA和載體通過一端為黏端、另一端為平端的方式進行連接。以該方式連接時，目的DNA被定向插入載體（定向克隆），連接效率介於黏端和平端連接之間。可採用提高平端連接效率的措施提高該方式的連接效率。

重組DNA轉入受體細胞使其得以擴增

重組DNA轉入宿主細胞後才能得到擴增。理想的宿主細胞通常是DNA/蛋白質降解系統和（或）重組酶缺陷株，這樣的宿主細胞稱為工程細胞。工程細胞具有較強的接納外源DNA的能力，可保證外源DNA長期、穩定地遺傳或表達。將重組DNA導入宿主細胞的常用方法有如下幾種：

1. 轉化 轉化(transfor mation)是指將外源DNA直接導入細菌、真菌的過程，例如，重組質體導入大腸埃希菌。然而，只有細胞膜通透性增加的細菌才容易接受外源DNA,這樣的細菌稱作感受態細胞(competent cells)。實現轉化的方法包括化學誘導法（如氯化鈣法）、電穿孔(electroporation)法等。此外，將質體DNA直接導入酵母細胞以及將黏粒DNA導入細菌的過程也稱作轉化。
2. 轉染 轉染(transfection)是指將外源DNA直接導入真核細胞（酵母除外）的過程。常用的轉染方法包括化學方法（如磷酸鈣共沉澱法、脂質體融合法等）和物理方法（如顯微注射法、電穿孔法等）。此外，將噬菌體DNA直接導入受體細菌的過程也稱作轉染。
3. 感染 感染(infection)是指以病毒顆粒作為外源DNA運載體導入宿主細胞的過程。例如，以噬菌體、逆轉錄病毒、腺病毒等DNA作為載體構建的重組DNA分子，經包裝形成病毒顆粒後進入宿主細胞。

重組體的篩選與鑑定

重組DNA分子導入宿主細胞後，可通過載體攜帶的選擇標記或目的DNA片段的序列特徵進行篩選和鑑定，從而獲得含重組DNA分子的宿主細胞。篩選和鑑定方法主要有遺傳標誌篩選法、序列特異性篩選法、親和篩選法等。
1、藉助載體上的遺傳標誌進行篩選 載體上通常攜帶可供重組體篩選的遺傳標誌，如抗生素抗性基因等，據此可對含重組DNA的宿主細胞進行篩選。
(1)利用抗生素抗性標誌篩選：將含有某種抗生素抗性基因的重組載體轉化宿主細胞，然後在含相應抗生素的培養液中培養此細胞，若細胞能在這種條件下生長，則說明細胞中至少應含有導入的載體，但是否是插入目的DNA的載體，還需要進一步鑑定。若細胞中沒有載體，則被抗生素殺死。
(2)利用基因的插入失活／插入表達特性篩選：針對某些帶有抗生素抗性基因的載體，當目的DNA插入抗性基因後，可使該抗性基因失活。如果還以這種抗生素抗性進行篩選，不能生長的細胞應該是含重組DNA的細胞。以這種方式篩選時，通常載體上攜帶一個以上篩選標誌基因。例如pBR322質體含有氨茉青黴素抗性基因(amp^R)和四環素抗性基因(tet^R), 如將目的DNA插入tet^R中，tet^R失活，含重組DNA的細胞只能在含氨苯青黴素的培養基中生長，而不能在含四環素的培養基中生長。
(3)利用標誌補救篩選：標誌補救(marker rescue)是指當載體上的標誌基因在宿主細胞中表達時，宿主細胞通過與標誌基因表達產物互補彌補自身的相應缺陷，從而在相應選擇培養基中存活。利用該策略可初步篩選含有載體的宿主細胞。例如，S.cerevisiae酵母菌株，因trpl 基因突變而不能在缺少色氨酸的培養基上生長，當轉入帶有功能性trpl 基因的重組載體後，轉化菌則能在色氨酸缺陷的培養基上生長。標誌補救也可用於外源基因導入哺乳類細胞後陽性克隆的初篩，例如，當將帶有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(dhfr)的真核表達載體導入dhfr 缺陷的哺乳類細胞後，則可使細胞在無胸腺嘧啶的培養基中存活，從而篩選出帶有載體的克隆(DHFR可催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，後者可用於合成胸腺嘧啶）。
(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選：λ噬菌體的一個重要遺傳特性就是其在包裝時對λDNA大小有嚴格要求，只有當λDNA的長度達到其野生型長度的75%～105%時，方能包裝形成有活性的噬菌體顆粒，進而在培養基上生長時呈現清晰的噬斑，而不含外源DNA的單一噬菌體載體DNA因其長度太小而不能被包裝成有活性的噬菌體顆粒，故不能感染細菌形成噬斑。根據此原理可初步篩出帶有重組入噬菌體載體的克隆。
2、序列特異性篩選 根據序列特異性篩選的方法包括RE酶切法、PCR法、核酸雜交法、DNA測序法等。
(1) RE酶切法：針對初篩為陽性的克隆，提取其重組DNA, 以合適的RE進行酶切消化，經瓊脂糖凝膠電泳便可判斷有無目的DNA片段的插入及插入片段的大小。同時，根據酶切位點在插入片段內部的不對稱分佈，還可鑑定插入DNA片段在載體上的方向；也可用多種RE製作並分析插入片段的酶切圖譜。
(2) PCR法：利用序列特異性引物，經PCR擴增，可鑑定出含有目的DNA的陽性克隆。如果利用克隆位點兩側載體序列設計引物進行PCR擴增，再結合序列分析，便能可靠地證實插入片段的方向、序列和可讀框的正確性。
(3)核酸雜交法：該方法可直接篩選和鑑定含有目的DNA的克隆。常用方法是菌落或噬斑原位雜交法：將轉有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纖維素膜上，細菌裂解後所釋放出的DNA將被吸附在膜上，將膜與標記的核酸探針雜交，通過檢測探針的存在即可鑑定出含有重組DNA的克隆。根據核酸探針標記物的不同，可通過放射自顯影、化學發光、 酶作用千底物顯色等方法來顯示探針的存在位置，也就是陽性克隆存在的位置。
(4)DNA測序法：該法是最準確的鑑定目的DNA的方法。針對已知序列，通過DNA測序可明確具體序列和可讀框的正確性；針對未知DNA片段，可揭示其序列，為進一步研究提供依據。
3、親和篩選法 親和篩選法的前提是重組DNA進入宿主細胞後能夠表達出其編碼產物。 常用的親和篩選法的原理是基於抗原-抗體反應或配體-受體反應。一般做法與上述菌落或噬斑核酸原位雜交相似，只是被檢測的靶分子換成吸附於硝酸纖維素膜上的蛋白質，檢測探針換成標記的抗體／抗原或配體／受體。

克隆基因的表達

採用重組DNA技術還可進行目的基因的表達，實現生命科學研究、醫藥或商業目的，這是基因工程的最終目標。基因表達涉及正確的基因轉錄、mRNA翻譯、適當的轉錄後及翻譯後的加工過程，這些過程對於不同的表達體系是不同的。克隆目的基因，進而大量地表達出有特殊意義的蛋白質，已成為重組DNA技術中一個專門的領域，這就是重組蛋白質表達。在蛋白質表達領域，表達體系的建立包括表達載體的構建、宿主細胞的建立及表達產物的分離、純化等技術和策略。基因工程中的表達系統包括原核和真核表達體系。
1、原核表達體系 E.coli是當前採用最多的原核表達體系，其優點是培養方法簡單、迅速、經濟而又適合大規模生產工藝。

• 原核表達載體的必備條件：運用E.coli的表達有用的蛋白質必須使構建的表達載體符合下述標準：①含E.coli適宜的選擇標誌；②具有能調控轉錄、產生大量mRNA的強啟動子，如lac、tac啟動 子或其他啟動子序列；③含適當的翻譯控制序列，如核糖體結合位點和翻譯起始點等；④含有合理設計的MCS,以確保目的基因按一定方向與載體正確連接。
• 重組蛋白質的表達策略：在實際工作中，蛋白質表達策略頗不一致。有時表達目的是為了獲得蛋白質抗原，以便製備抗體，此時要求表達的蛋白質或多肽具有抗原性，同時要求表達產物易於分 離、純化。較好的策略是為目的基因連上一個編碼標籤肽的序列，從而表達為融合蛋白(fusion protein)。在有些情況下，表達的蛋白質多為不溶性的包含體(inclusion body) , 極易與細菌蛋白質分離。如果在設計融合基因時，在目的基因和標籤序列之間加入適當的裂解位點，則很容易從表達的融合分子中去除標籤序列。巧妙地設計標籤序列還可大大方便表達產物的分離純化。如果表達的蛋白質是為了用於生物化學、細胞生物學研究或臨床診斷或基因防治，除分離純化方便，更重要的是考慮蛋白質的功能和生物學活性。此時，表達可溶性蛋白質往往具有特異的生物學功能；如果表達的是包含體形式，還需要在分離純化後進行復性或摺疊。
• E.coli表達體系的缺點：E.coli表達體系在實際應用中尚存在一些不足之處，諸如：①由於缺乏轉錄後加工機制，對於真核基因來說，E.coli表達體系只能表達經逆轉錄合成的cDNA編碼產物，不宜表達從基因組DNA上擴增的基因；②由於缺乏適當的翻譯後加工機制，真核基因的表達產物在E.coli表達體系中往往不能被正確的摺疊或糖基化修飾；③表達的蛋白質常常形成不溶性包含體，欲使其具有活性尚需進行複雜的變性-復性處理；④很難用 E.coli表達體系表達大量的可溶性蛋白質。

2、真核表達體系 真核表達體系除與原核表達體系有相似之處外，一般還常有自己的特點。真核表達載體通常含有供真核細胞用的選擇標記、啟動子、轉錄和翻譯終止信號、mRNA的poly(A)加尾信號或染色體整合位點等。
真核表達體系有酵母、昆蟲、哺乳類細胞等，不僅可以表達克隆的cDNA,也可表達從真核基因組 DNA擴增的基因。哺乳類細胞表達的蛋白質通常總是被適當的修飾，而且表達的蛋白質會恰當地分佈在細胞內一定區域並積累。因此，採用真核表達體系的優勢是：①具有轉錄後加工機制；②具有翻譯後修飾機制；③表達的蛋白質不形成包含體（酵母除外）；④表達的蛋白質不易被降解。當然，操作技術難、費時、費錢是其缺點。