生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/DNA的瓊脂糖凝膠電泳

實驗目的

瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經濟快速等優點。本實驗學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術，掌握有關的技術和識讀電泳圖譜的方法。

實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是常用的用於分離、鑑定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是鹼基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而pH8.0-8.3時，鹼基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。在中性或鹼性時，單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳動率大致相同。

影響核酸分子泳動率的主要因素

樣品的物理性狀

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言，電荷密度愈大，泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明顯。

對線形分子來說，分子量的常用對數與泳動率成反比，用此標準樣品電泳並測定其泳動率，然後進行DNA分子長度（bp）的負對數——泳動距離作標準曲線圖，可以用於測定未知分子的長度大小。

DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大，比如質體分子，泳動率的大小順序為：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由於瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現相反的情況。

支持物介質

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠兩種介質，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同，是於分離不同濃度範圍的核酸分子。聚丙烯醯胺凝膠由丙烯醯胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，並通過交聯劑N,N′-亞甲雙丙烯醯胺（Bis）交叉連接而成，其網孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長度100至60的分子，而聚丙烯醯胺凝膠對於小片段（5bp-500bp）的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小範圍的DNA分子。

電場強度

電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離範圍隨着電壓增大而減小，所以電泳時一般採用低電壓，不超過4V/cm。而對於大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯醯胺凝膠。

緩衝液離子強度

核酸電泳常採用TAE、TBE、TPE三種緩衝系統，但它們各有利弊。TAE價格低廉，但緩衝能力低，必須進行兩極緩衝液的循環。TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響後續反應。所以多採用TBE緩衝液。

在緩衝液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護DNA。

緩衝液pH常偏鹼性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間。在紫外線照射BE-DNA複合物時，出現不同的效應。254nm的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。

使用溴化乙錠對DNA樣品進行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻入DNA分子中，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，但是如果要測定核酸分子大小時，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結束後，把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min進行染色。BE見光分解，應在避光條件下4℃保存。

材料、試劑及器具

材料

1kbMarker（分子量標準）；DNA樣品

試劑

加樣緩衝液（6x）：0.25%溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）；酶液（10mg/ml）。

器具

1. 電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
2. 紫外透射儀。

操作步驟

1. 按所分離的DNA分子的大小範圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5×TBE電泳緩衝液。然後置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60℃左右，在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。
2. 取有機玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴，並滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。
3. 水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。
4. 待膠凝固後，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
5. 在槽內加入0.5×TBE電泳緩衝液，至液面覆蓋過膠面
6. 把待檢測的樣品，按以下量在潔淨載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
   • 1μl加樣緩衝液（6×）+5μl待測DNA樣品
   • 〔+0.5μlEB液（10mg/ml）（註：若膠內未加EB，可選用此法）。〕
7. 接通電泳儀和電泳槽，並接通電源，調節穩壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點樣端放陰極端。根據經驗調節電壓使分帶清晰。
8. 觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。
9. 染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置於一張保鮮膜或其他支持物上，放進EB溶液中進行染色，完全浸泡約30min。
10. 在紫外透視儀的樣品台上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然後把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm或254nm），通過觀察孔進行觀察。

注意事項

1. 電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染於衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區域操作，戴一次性手套，並及時更換。
2. 預先加入EB時可能使DNA的泳動速度下降15%左右，而且對不同構型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束後再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若膠內或樣品內已加EB，染色步驟可省略；若凝膠放置一段時間後才觀察，即使原來膠內或樣品已加EB，也建議增加此步。
3. 加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時清除，否則，需重新制膠。
4. 以0.5×TBE作為電泳緩衝液時，溴酚蘭在0.5%～1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動速度大約相當於300bp的線性DNA的泳動速度，而二甲苯青FF的泳動速度相當於4Kb的雙鏈線形DNA的泳動速度。