生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/DNA的瓊脂糖凝膠電泳

實驗目的 編輯

瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法,具有操作方便、經濟快速等優點。本實驗學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術,掌握有關的技術和識讀電泳圖譜的方法。

實驗原理 編輯

瓊脂糖凝膠電泳是常用的用於分離、鑑定DNA、RNA分子混合物的方法,這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電,在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下,DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價閉合環狀的超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA

核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是鹼基上的氨基解離,而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離,所以分子帶正電,在電場中向負極泳動;而pH8.0-8.3時,鹼基幾乎不解離,而磷酸基團解離,所以核酸分子帶負電,在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同,因此對泳動速度影響不大。在中性或鹼性時,單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳動率大致相同。

影響核酸分子泳動率的主要因素 編輯

樣品的物理性狀 編輯

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言,電荷密度愈大,泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同,所以對泳動率的影響不明顯。

對線形分子來說,分子量的常用對數與泳動率成反比,用此標準樣品電泳並測定其泳動率,然後進行DNA分子長度(bp)的負對數——泳動距離作標準曲線圖,可以用於測定未知分子的長度大小。

DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大,比如質粒分子,泳動率的大小順序為:cDNA>IDNA>ocDNA但是由於瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響,會出現相反的情況。

支持物介質 編輯

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠兩種介質,瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同,是於分離不同濃度範圍的核酸分子。聚丙烯醯胺凝膠由丙烯醯胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合形成長鏈,並通過交聯劑N,N′-亞甲雙丙烯醯胺(Bis)交叉連接而成,其網孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長度100至60的分子,而聚丙烯醯胺凝膠對於小片段(5bp-500bp)的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠,可以分離不同大小範圍的DNA分子。

電場強度 編輯

電場強度愈大,帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離範圍隨着電壓增大而減小,所以電泳時一般採用低電壓,不超過4V/cm。而對於大片段電泳,甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時,只能使用聚丙烯醯胺凝膠。

緩衝液離子強度 編輯

核酸電泳常採用TAE、TBE、TPE三種緩衝系統,但它們各有利弊。TAE價格低廉,但緩衝能力低,必須進行兩極緩衝液的循環。TPE在進行DNA回收時,會使DNA污染磷酸鹽,影響後續反應。所以多採用TBE緩衝液。

在緩衝液中加入EDTA,可以鰲合二價離子,抑制DNase,保護DNA。

緩衝液pH常偏鹼性或中性,此時核酸分子帶負電,向正極移動。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(ethidium bromide EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間。在紫外線照射BE-DNA複合物時,出現不同的效應。254nm的紫外線照射時,靈敏度最高,但對DNA損傷嚴重;360nm紫外線照射時,雖然靈敏度較低,但對DNA損傷小,所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高,且對DNA損傷不是很大,所以也比較適用。

使用溴化乙錠對DNA樣品進行染色,可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻入DNA分子中,可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況,但是如果要測定核酸分子大小時,不宜使用以上方法,而是應該在電泳結束後,把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10~30min進行染色。BE見光分解,應在避光條件下4℃保存。

材料、試劑及器具 編輯

材料 編輯

1kbMarker(分子量標準);DNA樣品

試劑 編輯

加樣緩衝液(6x):0.25%溴酚蘭,40%蔗糖;瓊脂糖;溴化乙錠(EB);酶液(10mg/ml)。

器具 編輯

  1. 電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
  2. 紫外透射儀。

操作步驟 編輯

  1. 按所分離的DNA分子的大小範圍,稱取適量的瓊脂糖粉末,放到一錐形瓶中,加入適量的0.5×TBE電泳緩衝液。然後置微波爐加熱至完全溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。冷卻至60℃左右,在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。
  2. 取有機玻璃制膠板槽,有透明膠帶沿膠槽四周封嚴,並滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。
  3. 水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液,使之形成均勻水平的膠面。
  4. 待膠凝固後,小心拔起梳子,撕下透明膠帶,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
  5. 在槽內加入0.5×TBE電泳緩衝液,至液面覆蓋過膠面
  6. 把待檢測的樣品,按以下量在潔淨載玻片上小心混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
    • 1μl加樣緩衝液(6×)+5μl待測DNA樣品
    • 〔+0.5μlEB液(10mg/ml)(註:若膠內未加EB,可選用此法)。〕
  7. 接通電泳儀和電泳槽,並接通電源,調節穩壓輸出,電壓最高不超過5V/cm,開始電泳。點樣端放陰極端。根據經驗調節電壓使分帶清晰。
  8. 觀察溴酚蘭的帶(藍色)的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處,可停止電泳。
  9. 染色:把膠槽取出,小心滑出膠塊,水平放置於一張保鮮膜或其他支持物上,放進EB溶液中進行染色,完全浸泡約30min。
  10. 在紫外透視儀的樣品台上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然後把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm或254nm),通過觀察孔進行觀察。

注意事項 編輯

  1. 電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質,務必小心,勿沾染於衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區域操作,戴一次性手套,並及時更換。
  2. 預先加入EB時可能使DNA的泳動速度下降15%左右,而且對不同構型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束後再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若膠內或樣品內已加EB,染色步驟可省略;若凝膠放置一段時間後才觀察,即使原來膠內或樣品已加EB,也建議增加此步。
  3. 加樣進膠時不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時清除,否則,需重新制膠。
  4. 以0.5×TBE作為電泳緩衝液時,溴酚蘭在0.5%~1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動速度大約相當於300bp的線性DNA的泳動速度,而二甲苯青FF的泳動速度相當於4Kb的雙鏈線形DNA的泳動速度。