生物化學與分子生物學/蛋白質的分離、純化與結構分析

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蛋白質是生物大分子，具有膠體性質、沉澱、變性和凝固等特點。人體的細胞和體液中存在成千上萬種蛋白質，要分析其中某種蛋白質的結構和功能，需要從混合物分離純化出單一蛋白質。蛋白質 分離通常是利用其特殊理化性質，採取鹽析、透析、電泳、層析及超速離心等不損傷蛋白質空間構象的物理方法， 以滿足研究蛋白質結構與功能的需要。

蛋白質沉澱用於蛋白質濃縮及分離

蛋白質在溶液中一般含量較低，需要經沉澱濃縮，以利進一步分離純化。

1. 有機溶劑沉澱蛋白質 丙酮、乙醇等有機溶劑可以使蛋白質沉澱，再將其溶解在小體積溶劑中即可獲得濃縮的蛋白質溶液。為保持蛋白質的結構和生物活性，需要在0～4℃低溫下進行丙酮或乙醇沉澱，沉澱後應立即分離，否則蛋白質會發生變性。
2. 鹽析分離蛋白質 鹽析(salt precipitation)是將硫酸按、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩定性因素去除而沉澱。各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度及 pH 均不同，可據此將不同的蛋白質予以分離。例如血清中的清蛋白和球蛋白，前者可溶於pH 7.0 左右的半飽和硫酸按溶液中，而後者在此溶液中則發生沉澱。當硫酸按溶液達到飽和時，清蛋白也隨之析出。所以鹽析法可將蛋白質初步分離，但欲得純品，尚需用其他方法。許多蛋白質經純化後，在鹽溶液中長期放置逐漸析出，成為整齊的結晶。
3. 免疫沉澱分離蛋白質 蛋白質具有抗原性，將某種純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白質的特異抗體。利用特異抗體識別相應抗原並形成抗原抗體複合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。這就是可用於特定蛋白質定性和定量分析的免疫沉澱法。在具體實驗中，常將抗體交聯至固相化的瓊脂糖珠上，易於獲得抗原抗體複合物。進一步將抗原抗體複合物溶於含十二烷基硫酸鈉和二琉基丙醇的緩衝液後加熱，使抗原從抗原抗體複合物分離而得以純化，並用於分析。

透析和超濾法去除蛋白質溶液中的小分子化合物

利用透析袋將大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法稱為透析(dialysis)。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纖維素膜製成，一般只允許分子量為lOkD以下的化合物通過。將蛋白質溶液裝在透析袋內置於水中，硫酸按氯化鈉等小分子物質可透過薄膜進入水溶液，由此可對鹽析濃縮後的蛋白質溶液進行除鹽。如果透析袋外放放置吸水劑如聚乙二醇，則袋內水分伴同小分子物質透出袋外，高分子量的蛋白質留在袋內，可達到濃縮目的。同樣，應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的，稱為超濾法悶。此法簡便且回收率高，是常用的濃縮蛋白質溶液方法。

電泳分離蛋白質

蛋白質在高於或低於其pI的溶液中成為帶電顆粒，在電場中能向正極或負極方向移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術稱為電泳(electrophoresis)。根據支撐物的不同有纖維薄膜電泳、凝膠電泳等。薄膜電泳是將蛋白質溶液點樣於薄膜上，薄膜兩端分別加正、負電極，此時帶正電荷的蛋白質向負極泳動；帶負電荷的蛋白質向正極泳動；帶電多，分子量小的蛋白質泳動速率快；帶電少，分子量大的則泳動慢，於是蛋白質被分離。凝膠電泳的支撐物為瓊脂糖、澱粉或聚丙烯醯胺凝膠。凝膠置於玻璃板上或玻璃管中，凝膠兩端分別加上正、負電極，蛋白質混合液即在凝膠中泳動。電泳結束後，用蛋白質顯色劑顯色，即可看到多條已被分離的蛋白質色帶。

1. SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質 若蛋白質樣品和聚丙烯醯胺凝膠系統中加入帶負電荷較多的十二烷基硫酸鈉(SDS),使所有蛋白質顆粒表面覆蓋一層 SDS 分子，導致蛋白質分子間的電荷差異消失，此時蛋白質在電場中的泳動速率僅與蛋白質顆粒大小有關，加之聚丙烯醯胺凝膠具有分子篩效應，因而此種稱之為 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-polyac1ylarnide gel eiectrophoresis, SDS-PAGE)。
2. 等點聚焦電泳分離蛋白質 如果在聚丙烯醯胺凝膠中加入系列兩性電解質載體，在電場中可形成一個連續而穩定的線性 pH 梯度，即 pH 從凝膠的正極向負極依次遞增。在這種介質中電泳時，被分離的蛋白質處在偏離其等電點的 pH 位置時帶有電荷而移動，當蛋白質泳動至與其自身的 pI值相等的 pH 區域時，其淨電荷為零而不再移動，這種通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法稱為等電聚焦電泳(isoelectric equilibrium electrophoresis, IEE)。
3. 雙向凝膠電泳分離蛋白質 人類基因組計劃完成後迎來了後基因組時代，其中蛋白質組學的研究頗受重視。雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)是蛋白質組學研究的重要技術之一。雙向凝膠電泳的第一向是蛋白質的IEE,第二向為SDS-PAGE,利用被分離蛋白質等電點和分子量的差異，將複雜蛋白質混合物在二維平面上分離。

層析分離蛋白質

層析(chromatography)是分離、純化蛋白質的重要手段之一。一般而言，待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反覆分配，並以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的。層析種類很多，有離子交換層析、凝膠過濾和親和層析等。其中離子交換層析和凝膠過濾應用最廣。
蛋白質和胺基酸一樣，是兩性電解質，在某一特定pH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析。層析柱內填滿帶有小孔的顆粒，一般由葡聚糖製成。蛋白質溶液加於柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離。

蛋白質顆粒沉降行為與超速離心分離

超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。蛋白質在高達500 OOOg(g為gravity,即地心引力單位）的重力作用下，在溶液中逐漸沉降，直至其浮力(buoyant force)與離心所產生的力相等，此時沉降停止。不同蛋白質其密度與形態各不相同，因此用上述方法可將它們分開。蛋白質在離心力場中的沉降行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系數(S)使用Svedberg單位(lS=l0^-13秒）。S與蛋白質的密度和形狀相關。

蛋白質的一級結構分析

F. Sanger耗時多年才在1953年基本完成了胰島素的一級結構測定，現今由於方法學改進及自動化分析儀器的產生，已有越來越多蛋白質的胺基酸序列問世。
1、離子交換層析分析蛋白質的胺基酸組分 首先分析已純化蛋白質的胺基酸殘基組成。蛋白質經鹽酸水解後成為個別胺基酸，用離子交換樹脂將各種胺基酸分開，測定它們的量，算出各胺基酸在蛋白質中的百分組成或個數。
2、測定多肽鏈的氨基端和羧基端的胺基酸殘基 第二步測定多肽鏈的氨基端與羧基端為何種胺基酸殘基。F.Sanger 最初用二硝基氟苯與多肽鏈的α-氨基作用生成二硝基苯胺基酸，然後將多肽水解，分離出帶有二硝基苯基的胺基酸。目前多用丹醯氯使之生成丹醯衍生物，該物質具強烈熒光，更易鑑別。羧基端胺基酸殘基可用羧肽酶將其水解下來進行鑑定。
3、肽鏈序列的測定 第三步是將肽鏈水解成片段，分別進行分析。常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、溴化氛法等。胰蛋白酶能水解賴氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽鍵。所以如果蛋白質分子中有4個精氨酸及賴氨酸殘基，則可得5個片段。胰凝乳蛋白酶水解芳香族胺基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）羧基側的肽鍵，溴化氰水解甲硫氨酸羧基側的肽鍵。
蛋白質水解生成的肽段，可通過層析和電泳及質譜將其分離純化並鑑定，得到的圖譜稱為肽圖 (peptide map), 由此可明確肽段的大小和數量。各肽段的胺基酸排列順序一般採用 Edman 降解法進行分析。將待測肽段先與異硫氰酸苯酯反應，該試劑只與氨基端胺基酸的游離α-氨基作用。再用冷稀酸處理，氨基端殘基即自肽鏈脫落下來，成為異硫氰酸苯酯衍生物，用層析可鑑定為何種胺基酸衍生物。殘留的肽鏈可繼續與異硫氰酸苯酯作用，依次逐個鑑定出胺基酸的排列順序。對分 析出的各肽段中的胺基酸順序，進行組合排列對比，最終得出完整肽鏈中的胺基酸排列順序。
近年來，由於核酸研究在理論上及技術上的迅猛發展，尤其是人全基因組測序的完成，各種蛋白 質的胺基酸序列已經可以通過核酸序列來推演。然而，蛋白質組學研究、生物製藥產品的鑑定等仍需要進行高效而準確的蛋白質的部分一級結構分析。

蛋白質的空間結構分析

大量生物體內存在的蛋白質空間結構的解析，對於研究蛋白質結構與功能的內在關係至關重要，也為蛋白質或多肽藥物的結構改造以致增強作用減弱副作用提供了理論依據。由於蛋白質的空間結構十分複雜，因而其測定的難度也較大，而且還需昂貴的儀器設備和先進的技術。隨着結構生物學的 發展，蛋白質二級結構和三維空間結構的測定也已普遍開展。 1、圓二色光譜法測定蛋白質二級結構 通常採用圓二色光譜(circular dichroism, CD)測定溶液狀態下的蛋白質二級結構。CD譜對二級結構非常敏感，α-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰等3個成分；而β-摺疊的CD譜不很固定。可見測定含α-螺旋較多的蛋白質，所得結果更為準確。
2、蛋白質三維空間結構解析 X射線繞射(X-ray diffraction)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技術是研究蛋白質三維空間結構的經典方法。X射線繞射法需要首先將蛋白質製備成晶體，X射線射至蛋白質晶體上，產生不同方向的繞射，收集繞射光束所產生的電子密度圖，可計算出空間結構。核磁共振技術主要用於測定蛋白質的液相三維空間結構。
冷凍電鏡 (cryo-electron microscopy) 技術的發明極大提高了蛋白質三維結構的解析速度和解像度，而且可以分析蛋白質在相對天然狀態下的結構，當前已經成為結構生物學的主要研究手段。
3、生物信息學預測蛋白質空間結構 由於蛋白質空間結構的基礎是一級結構，參照已經完成的各種蛋白質的三維結構數據庫，已經可以初步預測各種蛋白質的三維空間結構。