生物化学与分子生物学/PCR技术的原理与应用

常用的分子生物学技术及其应用 - 分子杂交和印迹技术 - PCR技术的原理与应用 - DNA测序技术 - 生物芯片技术 - 蛋白质的分离、纯化与结构分析 - 生物大分子相互作用研究技术
20 世纪 70 年代末，随着 DNA 重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题。1983 年K. Mullis 发明了聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 技术。该技术可将微量 DNA 片段大量扩增，使微量 DNA 或 RNA 的操作变得简单易行。PCR 技术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR 技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。
近年来，PCR 技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测定。该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。新的 PCR 技术类型层出不穷。

PCR技术的工作原理

PCR 的基本工作原理是在体外模拟体内 DNA 复制的过程。以待扩增的 DNA 分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的 DNA 两侧与模板 DNA 链互补结合，提供 3'-0H 末端；在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的 DNA 片段得到扩增。 PCR 反应的特异性依赖于与模板 DNA 两端互补的寡核苷酸引物。组成 PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA、特异引物、耐热性 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）、dNTP以及含有Mg²⁺的缓冲液。
PCR的基本反应步骤包括：①变性：将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除；②退火：将温度下降至适宜温度（一般较T_m低汽）使引物与模板DNA结合；③延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述3个步骤称为1个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环(25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。

PCR技术的主要用途

获得目的基因片段 PCR 技术为在重组 DNA 过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。在人类基因组计划完成之前，PCR 是从 cDNA 文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法。
DNA和RNA的微量分析 PCR技术敏感性高，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理论上讲，只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足 PCR 的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
DNA序列分析 将 PCR 技术引入 DNA 序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度，是实现高通量DNA 序列分析的基础。待测 DNA 片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。
基因突变分析 PCR 与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核昔酸探针分析、基因芯片技术、DNA 序列分析等。
基因的体外突变 在 PCR 技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作。现在，利用 PCR 技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造。

几种重要的PCR衍生技术

PCR 技术自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合形成了多种 PCR 衍生技术，提高了 PCR反应的特异性和应用的广泛性。本章仅举例介绍部分与医学研究密切相关的 PCR 衍生技术。

逆转录PCR技术

逆转录 PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR) 是将 RNA 的逆转录反应和 PCR 反应联合应用的一种技术。首先以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA,再以 cDNA 为模板通过 PCR 反应来扩增目的基因。RT-PCR 可检测到单个细胞中少于10个拷贝的特异的 RNA,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的 RNA 进行定性和半定量分析的最有效方法，也是最广泛使用的 PCR方法。

原位PCR技术

原位 PCR(in situ PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段。PCR反应在甲酸溶液（福尔马林）固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行。PCR反应后，再用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。由于常规PCR或RT-PCR技术的产物不能在组织细胞中直接定位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，而原位杂交技术虽有良好的定位效果，但灵敏度不高。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，将目的基因的扩增与定位相结合，既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值。

实时PCR技术

常规 PCR 反应是在反应终点检测产物含量，然而在反应过程中产物是以指数形式增加的，多次循环反应后的产物堆积将影响对原有模板含量差异的准确判断，故常规 PCR 反应只能作为半定量手段。实时 PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量 PCR(quantitative PCR, qPCR) 。定量 PCR 技术实现了 mRNA、miRNA 及其他非编码的RNA快速而准确的定量分析，已在临床应用于基因诊断。
1、实时PCR的基本技术原理 实时 PCR 的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，故也被称为实时荧光定量 PCR 或荧光定量 PCR。实时定量 PCR 需要采用专用 PCR 仪，自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行采集，实时记录荧光强度的改变，可以做到 PCR 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线。由于反应起始的模板DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系，利用荧光信号的实时监测和计算，可以准确地确定起始 DNA 拷贝数，从而对样品的浓度进行精确定量。
2、实时PCR技术的分类 荧光标记是实现 PCR 反应实时定量的化学基础。实时荧光定量 PCR 的化学原理包括引物探针类和非引物探针类两种。非引物探针类是利用非特异性的插入双链DNA 的荧光染料来指示扩增的增加，引物探针类则是利用可与靶 DNA 序列特异杂交结合的引物，标记荧光报告基团作为探针，来指示扩增产物的增加。

非引物探针类实时PCR：非引物探针类实时 PCR 加入的是能与双链 DNA 结合的荧光染料，由此来实现对 PCR 过程中产物量的全程监测，并不使用荧光来标记引物。最常用的是能结合到 DNA双螺旋小沟区域的荧光染料 SYER Green。该染料处于游离状态时，荧光信号强度较低，一旦与双链DNA结合之后，荧光信号强度大大增强（约为游离状态的 1000 倍）。荧光信号的强度与反应体系中的双链DNA(代表合成产物）的量成正比。因此，该荧光染料可用来实时监测 PCR 产物量的多少。由于非探针类实时 PCR 成本低廉，简便易行，近年来得到很快的发展，技术日趋完善，从而在基因表达的定量分析方面广泛应用。
引物探针类实时PCR: 与非引物探针类实时PCR相比，引物探针类实时PCR是通过使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号。探针除了能产生荧光信号用于监测PCR进程之外，还能和模板DNA待扩增区域结合，因此提高了PCR的特异性。目前，常用的探针类实时PCR包括TaqMan 探针法、分子信标(molecular beacons)探针法和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)探针法等。荧光探针由于增加了探针的互补识别步骤，特异性更高，且可采用多色荧光探针，可在一个反应中实现对数种不同基因表达水平的同时检测。

3、实时PCR的应用 实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法，是DNA定量技术的一次飞跃。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。这些应用将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，而是从本质上认识疾病和诊断疾病。

实时PCR在肿瘤领域的应用：实时定量PCR不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可用于肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估。实时荧光定量PCR可运用特异性荧光探针检测基因突变。可设计跨越疑似突变位点的荧光探针，进行基因扩增，然后对扩增产物进行缓慢加热获得熔解曲线，根据熔解曲线特征判断有无突变。也可使用双色标记探针进行突变检测，一个检测野生型，另一个标记的探针检测突变体。
实时PCR用于多态性分析：实时定量PCR技术在单核昔酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析方面亦有很好的应用前景，例如用于预测药物在同一疾病不同个体内的效应差异所致的治疗反应性不同，按照基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化的要求。
实时PCR用于病原体的检测：实时定量PCR技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测。例如，实时定量PCR不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量其DNA或RNA的序列，动态观测病程中潜在病毒数量，如对乙型肝炎病毒HBV的检测。以往对乙肝病毒的检测主要依靠乙肝表面抗原(HBsAg)这种间接指标，然而HBsAg阳性或阴性很难判断病人体内的HBV是否处于复制期，病毒复制的量又如何，以及病人是否具有传染性。实时定量PCR的出现，可准确地检测出标本中 HBV的拷贝数，实时监测病人的药物治疗效果和临床状态。