生物化學與分子生物學/PCR技術的原理與應用

常用的分子生物學技術及其應用 - 分子雜交和印跡技術 - PCR技術的原理與應用 - DNA測序技術 - 生物晶片技術 - 蛋白質的分離、純化與結構分析 - 生物大分子相互作用研究技術
20 世紀 70 年代末，隨著 DNA 重組技術的產生和發展，如何快速獲得目的基因（待檢測或待研究的特定基因）片段已經成為瓶頸問題。1983 年K. Mullis 發明了聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) 技術。該技術可將微量 DNA 片段大量擴增，使微量 DNA 或 RNA 的操作變得簡單易行。PCR 技術 的高敏感、高特異、高產率、可重複、快速簡便等優點使其迅速成為分子生物學研究中應用最為廣泛的方法，許多以往無法解決的分子生物學研究難題得以解決。PCR 技術的發明是分子生物學的一項革命，極大地推動了分子生物學以及生物技術產業的發展，成為分子生物學與醫學的支撐技術。
近年來，PCR 技術不斷改進，從手工操作發展到自動化儀器，從定性分析發展到定量測定。該方法與其他分子生物學技術相結合，其用途日益廣泛。新的 PCR 技術類型層出不窮。

PCR技術的工作原理

PCR 的基本工作原理是在體外模擬體內 DNA 複製的過程。以待擴增的 DNA 分子為模板，用兩條寡核苷酸片段作為引子，分別在擬擴增片段 的 DNA 兩側與模板 DNA 鏈互補結合，提供 3'-0H 末端；在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留複製的機制沿著模板鏈延伸直至完成兩條新鏈的合成。不斷重複這一過程，即可使目的 DNA 片段得到擴增。 PCR 反應的特異性依賴於與模板 DNA 兩端互補的寡核苷酸引子。組成 PCR 反應體系的基本成分包括模板 DNA、特異引子、耐熱性 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）、dNTP以及含有Mg²⁺的緩衝液。
PCR的基本反應步驟包括：①變性：將反應體系加熱至95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引子自身以及引子之間存在的局部雙鏈也得以消除；②退火：將溫度下降至適宜溫度（一般較T_m低汽）使引子與模板DNA結合；③延伸：將溫度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應。上述3個步驟稱為1個循環，新合成的DNA分子繼續作為下一輪合成的模板，經多次循環(25～30次）後即可達到擴增DNA片段的目的。

PCR技術的主要用途

1. 獲得目的基因片段 PCR 技術為在重組 DNA 過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。在人類基因組計劃完成之前，PCR 是從 cDNA 文庫或基因組文庫中獲得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，該技術是從各種生物標本或基因工程載體中快速獲得已知序列目的基因片段的主要方法。
2. DNA和RNA的微量分析 PCR技術敏感性高，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理論上講，只要存在1分子的模板，就可以獲得目的片段。實際工作中，1滴血液、1根毛髮或1個細胞已足以滿足 PCR 的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應用前景。
3. DNA序列分析 將 PCR 技術引入 DNA 序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度，是實現高通量DNA 序列分析的基礎。 待測 DNA 片段既可克隆到特定的載體後進行序列測定，也可直接測定。
4. 基因突變分析 PCR 與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性，例如單鏈構象多態性分析、等位基因特異的寡核昔酸探針分析、基因晶片技術、DNA 序列分析等。
5. 基因的體外突變 在 PCR 技術建立以前，在體外對基因進行各種突變是一項費時費力的工作。現在，利用 PCR 技術可以隨意設計引子在體外對目的基因片段進行插入、嵌和、缺失、點突變等改造。

幾種重要的PCR衍生技術

PCR 技術自身的發展及其與已有分子生物學技術的結合形成了多種 PCR 衍生技術，提高了 PCR反應的特異性和應用的廣泛性。本章僅舉例介紹部分與醫學研究密切相關的 PCR 衍生技術。

逆轉錄PCR技術

逆轉錄 PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR) 是將 RNA 的逆轉錄反應和 PCR 反應聯合應用的一種技術。首先以 RNA 為模板，在逆轉錄酶的作用下合成 cDNA,再以 cDNA 為模板通過 PCR 反應來擴增目的基因。RT-PCR 可檢測到單個細胞中少於10個拷貝的特異的 RNA,是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的 RNA 進行定性和半定量分析的最有效方法，也是最廣泛使用的 PCR方法。

原位PCR技術

原位 PCR(in situ PCR)是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的基因片段。PCR反應在甲酸溶液（福馬林）固定、石蠟包埋的組織切片或細胞塗片上的單個細胞內進行。PCR反應後，再用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。由於常規PCR或RT-PCR技術的產物不能在組織細胞中直接定位，因而不能與特定的組織細胞特徵表型相聯繫，而原位雜交技術雖有良好的定位效果，但靈敏度不高。原位PCR方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，將目的基因的擴增與定位相結合，既能分辯鑑定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，在分子和細胞水平上研究疾病的發病機制和臨床過程有重大的實用價值。

實時PCR技術

常規 PCR 反應是在反應終點檢測產物含量，然而在反應過程中產物是以指數形式增加的，多次循環反應後的產物堆積將影響對原有模板含量差異的準確判斷，故常規 PCR 反應只能作為半定量手段。實時 PCR(real-time PCR)技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析 的干擾，亦被稱為定量 PCR(quantitative PCR, qPCR) 。定量 PCR 技術實現了 mRNA、miRNA 及其他非編碼的RNA快速而準確的定量分析，已在臨床應用於基因診斷。
1、實時PCR的基本技術原理 實時 PCR 的基本原理是在 PCR 反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個 PCR 進程，故也被稱為實時螢光定量 PCR 或螢光定量 PCR。實時定量 PCR 需要採用專用 PCR 儀，自動在每個循環的特定階段對反應體系的螢光強度進行採集，實時記錄螢光強度的改變，可以做到 PCR 每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線。由於反應起始的模板DNA量與循環過程的指數期的擴增產物量之間存在著定量關係，利用螢光信號的實時監測和計算，可以準確地確定起始 DNA 拷貝數，從而對樣品的濃度進行精確定量。
2、實時PCR技術的分類 螢光標記是實現 PCR 反應實時定量的化學基礎。實時螢光定量 PCR 的化學原理包括引子探針類和非引子探針類兩種。非引子探針類是利用非特異性的插入雙鏈DNA 的螢光染料來指示擴增的增加，引子探針類則是利用可與靶 DNA 序列特異雜交結合的引子，標記螢光報告基團作為探針，來指示擴增產物的增加。

• 非引子探針類實時PCR：非引子探針類實時 PCR 加入的是能與雙鏈 DNA 結合的螢光染料，由此來實現對 PCR 過程中產物量的全程監測，並不使用螢光來標記引子。最常用的是能結合到 DNA雙螺旋小溝區域的螢光染料 SYER Green。該染料處於游離狀態時，螢光信號強度較低，一旦與雙鏈DNA結合之後，螢光信號強度大大增強（約為游離狀態的 1000 倍）。螢光信號的強度與反應體系中的雙鏈DNA(代表合成產物）的量成正比。因此，該螢光染料可用來實時監測 PCR 產物量的多少。由於非探針類實時 PCR 成本低廉，簡便易行，近年來得到很快的發展，技術日趨完善，從而在基因表達的定量分析方面廣泛應用。
• 引子探針類實時PCR: 與非引子探針類實時PCR相比，引子探針類實時PCR是通過使用螢光標記的引子為探針來產生螢光信號。探針除了能產生螢光信號用於監測PCR進程之外，還能和模板DNA待擴增區域結合，因此提高了PCR的特異性。目前，常用的探針類實時PCR包括TaqMan 探針法、分子信標(molecular beacons)探針法和螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)探針法等。螢光探針由於增加了探針的互補識別步驟，特異性更高，且可採用多色螢光探針，可在一個反應中實現對數種不同基因表達水平的同時檢測。

3、實時PCR的應用 實時定量PCR技術具有定量、特異、靈敏和快速等特點，是目前檢測目的核酸拷貝數的可靠方法，是DNA定量技術的一次飛躍。目前實時螢光PCR技術已經被廣泛應用於基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域。這些應用將改變以往對疾病的表型認識和表型 診斷，而是從本質上認識疾病和診斷疾病。

• 實時PCR在腫瘤領域的應用：實時定量PCR不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可用於腫瘤早期診斷、鑑別、分型、分期、治療及預後評估。實時螢光定量PCR可運用特異性螢光探針檢測基因突變。可設計跨越疑似突變位點的螢光探針，進行基因擴增，然後對擴增產物進行緩慢加熱獲得熔解曲線，根據熔解曲線特徵判斷有無突變。也可使用雙色標記探針進行突變檢測，一個檢測野生型，另一個標記的探針檢測突變體。
• 實時PCR用於多態性分析：實時定量PCR技術在單核昔酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析方面亦有很好的應用前景，例如用於預測藥物在同一疾病不同個體內的效應差異所致的治療反應性不同，按照基因多態性的特點用藥，將會使臨床治療符合個體化的要求。
• 實時PCR用於病原體的檢測：實時定量PCR技術還可用於多種細菌、病毒、支原體、衣原體的檢測。例如，實時定量PCR不僅能對病毒定性，而且由於其實驗的批間和批內差異小，重複性好，因此能方便、快速、靈敏、準確地定量其DNA或RNA的序列，動態觀測病程中潛在病毒數量，如對B型肝炎病毒HBV的檢測。以往對B肝病毒的檢測主要依靠B肝表面抗原(HBsAg)這種間接指標，然而HBsAg陽性或陰性很難判斷病人體內的HBV是否處於複製期，病毒複製的量又如何，以及病人是否具有傳染性。實時定量PCR的出現，可準確地檢測出標本中 HBV的拷貝數，實時監測病人的藥物治療效果和臨床狀態。