使用Kallisto進行alignment-free的定量編輯

這款軟件是2016年發表在NBT上的一款RNA-seq的計數軟件，文章標題為《Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification》（http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3519）

這款軟件對比TopHat+cufflinks，Hisat+HTseq等流程組合，就時間上要快很多。

而該軟件的核心思想是省略了將原始數據fastq文件比對到擦靠基因組上，然後再計數這一過程，取而代之的是直接將fq文件的reads比對參考轉錄組上並且直接計數。

Kallisto相關連結編輯

Kallisto的安裝編輯

Mac系統編輯

ruby -e "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/master/install)"
brew install kallisto

bioconda安裝編輯

conda install kallisto

Mac OS X, NetBSD, RHEL/CentOS 和 SmartOS 編輯

pkgin install kallisto

Kallisto的使用編輯

kallisto的9個子命令編輯

用法: kallisto <CMD> [arguments] ..

Where <CMD> can be one of:

    index         构建kallisto的索引
    quant         运行定量程序
    bus           生成用于单细胞数据的BUS文件 files for single-cell data
    pseudo        运行伪比对步骤
    merge         合并多次运行的结果
    h5dump        将HDF5格式的结果转换为普通文本文件
    inspect       检查并给出索引的信息
    version       打印版本信息
    cite          打印参考文献信息

kallisto index：從目標序列的 FASTA 格式文件構建索引編輯

构建kallisto索引

用法: kallisto index [参数] FASTA文件

必须参数:
-i, --index=STRING          创建的kallisto索引的文件名 

Optional argument:
-k, --kmer-size=INT         k-mer (odd) 长度 (默认: 31, 最大值: 31)
    --make-unique           去重重复的名称

提供的 Fasta 文件可以是純文本格式或 gzip 格式。從 Ensembl 參考轉錄組構建的預構建索引可以從 kallisto 轉錄組索引站點下載。

kallisto quant：進行定量編輯

计算reads和定量丰度

用法: kallisto quant [参数] FASTQ文件

必须参数:
-i, --index=STRING            用于定量的的kallisto索引的文件名
-o, --output-dir=STRING       输出结果的文件夹名

可选参数:
    --bias                    执行序列偏好性校正
-b, --bootstrap-samples=INT   bootstrap抽样的次数 (default: 0)
    --seed=INT                bootstrap抽样的种子数 (default: 42)
    --plaintext               输出文本文件，不输出HDF5格式
    --fusion                  搜索Pizzly融合
    --single                  对single-end reads定量
    --single-overhang         包括预测未观察到的片段的其余部分位于转录本之外的read
    --fr-stranded             链特异性reads, first read forward
    --rf-stranded             链特异性reads, first read reverse
-l, --fragment-length=DOUBLE  估算fragment的平均长度
-s, --sd=DOUBLE               估算fragment长度的标准差
                              (default: -l, -s 该值通过paired-end数据计算，使用--single时，需要该值)
-t, --threads=INT             使用的线程数 (default: 1)
    --pseudobam               保存转录组的伪比对结果到BAM文件
    --genomebam               保存伪比对结果为排序后的BAM文件
-g, --gtf                     GTF文件格式的转录组信息 (需要--genomebam)
-c, --chromosomes             制表符分隔的染色体名称和长度 (推荐和--genomebam一起使用)

kallisto 可以處理單端或雙端讀取。默認的運行模式是雙端的，需要偶數個 FASTQ 文件以成對的形式表示，例如

kallisto quant -i index -o output pairA_1.fastq pairA_2.fastq pairB_1.fastq pairB_2.fastq

對於單端模式，提供標誌以及選項，並列出任意數量的 FASTQ 文件，例如--single-l-s

kallisto quant -i index -o output --single -l 200 -s 20 file1.fastq.gz file2.fastq.gz file3.fastq.gz

FASTQ 文件可以是純文本格式或 gzip 格式。

重要提示：一次只向 kallisto 提供一個樣品。多個 FASTQ（對）選項適用於擁有跨越多個 FASTQ 文件的樣本的用戶。

在單端讀取的情況下，必須使用 -l 選項來指定平均片段長度。典型的 Illumina 文庫產生的片段長度範圍為 180–200 bp，但最好通過使用安捷倫生物分析儀等儀器進行文庫定量來確定。對於雙端讀取，平均片段長度可以直接從讀取中估計，如果不使用 -l，程序將這樣做（這是首選的運行模式）。對於由 3' 端測序產生的讀數，該選項不會丟棄預期片段大小超出轉錄本起始位置的讀數。--single-overhang

使用 -b 指定引導程序樣本的數量。請注意，由於引導程序樣本數量較多時可能會產生大量數據，因此 kallisto 以 HDF5 格式輸出引導程序結果。之後可以使用該命令將此輸出轉換為純文本，但最方便的是使用 sleuth.h5dump 分析引導程序結果。

kallisto quant 默認生成三個輸出文件：

abundances.h5 是一個 HDF5 二進制文件，包含運行信息、豐度估計、引導程序估計和轉錄本長度信息長度。這個文件可以被sleuth讀入
abundances.tsv 是豐度估計的純文本文件。它不包含引導估計。請使用模式輸出明文豐度估計。或者，可用於將 HDF5 文件輸出為純文本。第一行包含每列的標題，包括估計計數、TPM、有效長度。--plaintextkallisto h5dump
run_info.json 是一個包含運行信息的 json 文件

可選參數

--bias 學習序列特定偏差模型的參數並相應地糾正豐度。
-t, --threads 指定用於偽對齊和運行引導程序的線程數。默認值為 1 個線程，指定多於引導程序的數量或機器上的內核數量沒有額外影響。
--fr-stranded 以鏈特定模式運行 kallisto，僅處理對中的第一個讀取與轉錄本的正向鏈進行偽對齊的片段。如果一個片段與多個轉錄本偽對齊，則只保留與第一次讀取一致的轉錄本。
--rf-stranded 與第一次讀取映射到轉錄本的反向鏈相同。--fr-stranded
--fusion 進行正常的量化，但另外尋找不偽對齊的讀取，因為它們可能來自融合基因。所有輸出都寫入輸出文件夾中的文件.fusion.txt

Pseudobam

--pseudobam 將所有偽對齊輸出到輸出目錄中的文件中。此 BAM 文件包含 BAM 格式的偽對齊，按讀取排序，以便讀取的每個偽對齊在 BAM 文件中相鄰。pseudoalignments.bam

SAM 輸出的詳細說明在此處。

GenomeBam

--genomebam 構建與轉錄組的假比對，但將轉錄本比對投射到基因組坐標上，從而導致拆分讀取比對。當在 GTF 文件中提供選項時，必須隨選項一起提供。 GTF 文件可以是純文本或 gzipped，將轉錄本轉換為基因組坐標。我們建議從同一數據源下載 cdna FASTA 文件和 GTF 文件。該選項可以提供基因組染色體的長度，該選項不是必需的，但會提供更一致的 BAM 標頭，某些程序可能需要此用於下游分析。 kallisto 不需要基因組序列進行假比對，但下游工具如基因組瀏覽器可能需要它。--genomebam--gtf--chromosomes

kallisto bus：適用於單細胞 RNA-Seq 數據集的原始 FASTQ 文件編輯

對於每次讀取，單元條碼和 UMI 信息以及由偽對齊產生的等價類都存儲在輸出目錄目錄中的 BUS 文件中，並存儲有關等價類和轉錄名稱的信息，用於下游處理。 output.busmatrix.ectranscripts.txt

生成单细胞测序的BUS文件

用法: kallisto bus [参数] FASTQ文件

必须参数:
-i, --index=STRING            用于pseudoalignment的kallisto索引文件
-o, --output-dir=STRING       输出文件夹名
-x, --technology=STRING       使用的单细胞测序方法 

可选参数:
-l, --list                    列出支持的单细胞计数
-t, --threads=INT             使用的线程数 (default: 1)

要進一步處理文件，請使用 bustools；下游處理的示例可以在 bustools repository.output.bus 提供的數據集特定筆記本中看到運行給出了當前支持的單細胞技術列表kallisto bus -l

支持的单细胞测序技术

简称              描述
----------       -----------
10xv1            10x version 1 chemistry
10xv2            10x version 2 chemistry
10xv3            10x version 3 chemistry
CELSeq           CEL-Seq
CELSeq2          CEL-Seq version 2
DropSeq          DropSeq
inDrops          inDrops
SCRBSeq          SCRB-Seq
SureCell         SureCell for ddSEQ

指定輸入時，短名稱可用於指示技術。

此外，將接受一個字符串，指定一種新技術，格式為 where 每個 , 並且是由逗號分隔的整數三元組，表示文件索引、所用序列的開始和停止。例如，指定我們將使用的技術。第一部分表示它在第 0 個文件中（也稱為第一個文件），條碼從第 0 個 bp 開始到第 16 個 bp 結束（即 16bp 條碼） , UMI 類似地在同一個文件中，緊跟在位置 16-26（10bp UMI）的條形碼之後，最後序列在一個單獨的文件中，從 0 開始到 0 結束（在這種情況下，停在 0 意味着那裏沒有限制，我們使用整個序列）。kallisto busbc:umi:seqbcumiseq10xV20,0,16:0,16,26:1,0,0bc0,0,16

kallisto pseudo：僅運行偽比對步驟，用於單細胞 RNA-seq 編輯

计算读数的等价类并量化丰度

用法: kallisto pseudo [参数] FASTQ文件

必须参数:
-i, --index=STRING            用于pseudoalignment的kallisto索引文件名
-o, --output-dir=STRING       输出文件夹

可选参数:
-u  --umi                     第一个pair中的UMI文件
-b  --batch=FILE              需要处理的文件
    --single                  single-end reads的定量
-l, --fragment-length=DOUBLE  估算的fragment的平均长度
-s, --sd=DOUBLE               估算的fragment长度的方差(default: -l, -s 使用双末端数据计算，使用--single需要提供该值)
-t, --threads=INT             用于计算的线程数 (default: 1)

命令的形式和參數的含義與 quant 命令相同。但是，pseudo 不運行 EM 算法來量化豐度。此外，偽命令有一個選項可以在批處理文件中指定許多單元格，例如

kallisto pseudo -i index -o output -b batch.txt

它將讀取有關文件中每個細胞的信息並同時處理所有細胞 batch.txt 批處理文件的格式是

#id file1 file 2
cell1 cell1_1.fastq.gz cell1_1.fastq.gz
cell2 cell2_1.fastq.gz cell2_1.fastq.gz
cell3 cell3_1.fastq.gz cell3_1.fastq.gz
...

其中第一列是單元格的 id，接下來的兩個字段是包含配對末端讀數的相應文件。任何以開頭的行都將被忽略。在單端讀取的情況下，用指定，每個單元只能指定一個文件。#--single 當指定選項時，批處理文件的格式為--umi

#id umi-file file-1
cell1 cell_1.umi cell_1.fastq.gz
cell2 cell_2.umi cell_2.fastq.gz
cell3 cell_3.umi cell_3.fastq.gz
...

其中 umi-file 是表單的文本文件

TTACACTGAC
CCACTCTATG
CAGGAAATCG
...

列出每個讀取的唯一分子標識符 (UMI)。在 fastq 文件中 UMI 和讀取的順序必須匹配。即使 UMI 數據是單端的，我們也不需要或使用片段長度。

當在 UMI 模式下運行時，kallisto 將使用序列讀取來偽對齊並找到一個等價類，但不是計算每個等價類的讀取數量，kallisto 計算與每個等價類偽對齊的不同 UMI 的數量。

kallisto h5dump：將 HDF5 格式的結果轉換為純文本編輯

用法:  kallisto h5dump [参数] abundance.h5

必须参数:
-o, --output-dir=STRING       输出文件夹

kallisto merge：可以合併由執行的多個批次的結果，輸出為一個樣本編輯

计算读数的等价类并量化丰度

用法: kallisto merge [参数] ouput-directories

需要参数:
-i, --index=STRING            用于pseudoalignment的kallisto索引文件
-o, --output-dir=STRING       输出文件夹

kallisto inspect 編輯

kallisto inspect 可以通過兩種方式輸出索引中的 Target de Bruijn Graph，作為文件格式，或者它可以以可以使用 IGV 可視化的格式映射圖和等價類的重疊群。

Usage: kallisto inspect INDEX索引文件

可选参数:
-G, --gfa=STRING        T-DBG的GFA的输出文件
-g, --gtf=STRING        GTF文件名
-b, --bed=STRING        BED输出文件名 (default: index + ".bed")

生物信息學/kallisto

目次

使用Kallisto進行alignment-free的定量編輯

Kallisto相關連結編輯

Kallisto的安裝編輯

Mac系統編輯

bioconda安裝編輯

Mac OS X, NetBSD, RHEL/CentOS 和 SmartOS 編輯

Kallisto的使用編輯

kallisto的9個子命令編輯

kallisto index：從目標序列的 FASTA 格式文件構建索引編輯

kallisto quant：進行定量編輯

kallisto bus：適用於單細胞 RNA-Seq 數據集的原始 FASTQ 文件編輯

kallisto pseudo：僅運行偽比對步驟，用於單細胞 RNA-seq 編輯

kallisto h5dump：將 HDF5 格式的結果轉換為純文本編輯

kallisto merge：可以合併由執行的多個批次的結果，輸出為一個樣本編輯

kallisto inspect 編輯

生物信息學/kallisto

使用Kallisto進行alignment-free的定量 編輯

Kallisto相關連結 編輯

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Mac系統 編輯

bioconda安裝 編輯

Mac OS X, NetBSD, RHEL/CentOS 和 SmartOS 編輯

Kallisto的使用 編輯

kallisto的9個子命令 編輯

kallisto index：從目標序列的 FASTA 格式文件構建索引 編輯

kallisto quant：進行定量 編輯

kallisto bus：適用於單細胞 RNA-Seq 數據集的原始 FASTQ 文件 編輯

kallisto pseudo：僅運行偽比對步驟，用於單細胞 RNA-seq 編輯

kallisto h5dump：將 HDF5 格式的結果轉換為純文本 編輯

kallisto merge：可以合併由執行的多個批次的結果，輸出為一個樣本 編輯

kallisto inspect 編輯

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kallisto bus：適用於單細胞 RNA-Seq 數據集的原始 FASTQ 文件編輯

kallisto h5dump：將 HDF5 格式的結果轉換為純文本編輯

kallisto merge：可以合併由執行的多個批次的結果，輸出為一個樣本編輯