生物化學與分子生物學/重組DNA技術在醫學中的應用
DNA重組和重組DNA技術 -
自然界的DNA重組和基因轉移 -
重組DNA技術 -
重組DNA技術在醫學中的應用
目前,重組DNA技術已廣泛應用於生命科學和醫學研究、疾病診斷與防治、法醫學鑑定、物種的修飾與改造等諸多領域,對醫學臨床及醫學研究的影響日益增大。
重組DNA技術廣泛應用於生物製藥
編輯利用重組DNA技術生產有應用價值的藥物是當今醫藥發展的一個重要方向,有望成為21世紀的支柱產業之一。該技術一方面可用於改造傳統的製藥工業,如利用該基因可改造製藥所需要的工程菌種或創建新的工程菌種,從而提高抗生素、維生素、胺基酸等藥物的產量;另一方面利用該技術生產有藥用價值的蛋白質/多肽及疫苗抗原等產品,重組人胰島素是利用該技術生產的世界上第一個基因工程產品。目前上市的基因工程藥物已百種以上。
利用重組 DNA 技術,可以讓細菌、酵母等低等生物成為製藥工廠,也使基因工程細菌成為各類生 物基因的儲藏所;可以將小鼠雜交瘤細胞人源化,讓其產生人源化抗體;可以製造基因工程病毒,使病毒保留免疫原性,缺乏感染性或變成不含核酸的類病毒顆粒(virus-like particle, VLP) 。
重組DNA技術是醫學研究的重要技術平台
編輯重組 DNA 技術可用於醫學研究的很多方面,諸如遺傳修飾動物模型的建立、遺傳修飾細胞模型的建立、基因獲得或喪失對生物功能的影響等。
- 遺傳修飾動物模型的醫用研究 重組 DNA 技術可用於遺傳修飾動物模型的研製,從而建立人類疾病的動物模型。目前已經建立了諸多人類疾病的遺傳修飾動物模型,用於研究癌症、糖尿病、肥胖、心臟病、老化、關節炎等;遺傳修飾豬模型的應用,可望增加從豬到人器官移植 (pig to human organ transplantation) 的成功率;改造蚊子的基因組,使其產生對瘧疾的免疫反應,可望消滅瘧疾。
- 遺傳修飾細胞模型在醫學研究中的應用 重組 DNA 技術也可用於遺傳修飾細胞模型的建立,從而用於基因替代治療/靶向治療,或體內示蹤。體細胞基因治療(somatic gene therapy) 已經在 X-連鎖聯合免疫缺陷病(X-linked SCID)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lyrnphocytic leukemia,CLL)和帕金森病進行了臨床研究,這是在人體上進行遺傳工程的研究。改造 T 淋巴細胞,讓其攜帶嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR), 從而達到靶向治療疾病的 CAR-T 細胞也是採用重組 DNA 技術實現的。例如,人T細胞經基因操作成為靶向 CD19 的 CAR-T,用於治療難治性慢性B淋巴瘤。將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 與細胞內的某些蛋白相融合,可使細胞變成具有示蹤作用的發光細胞。
- 基因及基因功能的獲得及喪失的研究 基因工程生物或細胞模型可用來發現一些基因的新功能,或發現新基因,一般可通過基因的獲得(如轉基因)或喪失(如基因敲除)進行研究,也可通過示蹤實驗(如 GFP 融合蛋白)研究基因表達產物的定位或相互作用信息等,或通過報告基因(如 GFP 或催化特定底物的酶)與不同啟動子相融合的方法實現對基因表達調控的研究。
重組DNA技術是基因及其表達產物研究的技術基礎
編輯重組 DNA 技術已經成為基因或基因功能獲得或喪失研究的技術基礎,也是基因表達產物相互作用研究的技術基礎。
- 在基因組水平上干預基因 重組 DNA 技術是基因打靶(包括基因敲除和基因敲入)及基因組編輯等的技術基礎。例如,基因敲除(gene knock-out) , 傳統的方法是利用同源重組的原理,用目的基因替換基因組上的特定基因,要實現這一目標,需要將目的基因克隆到合適的載體上,並在其兩側加上待敲除基因上的部分序列,使重組 DNA 進入細胞後能通過同源重組替換基因組的目標基因。條件性基因打靶 (conditional gene targeting) 是在目的基因兩側構建了 Cre 重組酶的切割位點。基因組編輯(genome editing) 是指一類能定向地在基因組上改變基因序列的技術,其中 CRISPR/Cas9 系統是目前應用最多的、脫靶最少的基因組編輯技術,也是細菌抵抗病毒感染的一種獲得性免疫機制。利用CRISPR/Cas9 基因組編輯技術對特定基因進行改造,也需要在體外構建含導向 crRNA (guide crRNA, gcrRNA) 和 Cas9 編碼基因的重組載體,然後將這種重組載體導入受體細胞,才能實現在基因組水平定向地改變特定基因的目的。
- 在RNA水平上干預基因的功能 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 是通過干擾小 RNA (small interference RNA, siRNA) 與靶 RNA結合,從而阻止基因表達的方法。siRNA 可以直接採用化學法合成,也可以利用 DNA 克隆技術構建干擾小髮夾 RNA, 即將編碼 siRNA 反向互補序列和間隔序列(linker) 克隆入合適的載體,在細胞內轉錄合成干擾小髮夾 RNA,實現 RNA 干擾目的。
- 研究蛋白質的相互作用 重組DNA技術也是蛋白質相互作用研究的技術基礎。例如,酵母雙雜交系統(yeast two-hybrid system)是利用分別克隆轉錄因子DNA結合結構域(DNA binding domain, DBD)和轉錄激活結構域(transcription activating domain, TAD)的融合基因,對DBD-融合蛋白和TAD融合蛋白的融合部分的潛在相互作用能力進行研究。