生物化学与分子生物学/重组DNA技术在医学中的应用
DNA重组和重组DNA技术 -
自然界的DNA重组和基因转移 -
重组DNA技术 -
重组DNA技术在医学中的应用
目前,重组DNA技术已广泛应用于生命科学和医学研究、疾病诊断与防治、法医学鉴定、物种的修饰与改造等诸多领域,对医学临床及医学研究的影响日益增大。
重组DNA技术广泛应用于生物制药
编辑利用重组DNA技术生产有应用价值的药物是当今医药发展的一个重要方向,有望成为21世纪的支柱产业之一。该技术一方面可用于改造传统的制药工业,如利用该基因可改造制药所需要的工程菌种或创建新的工程菌种,从而提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量;另一方面利用该技术生产有药用价值的蛋白质/多肽及疫苗抗原等产品,重组人胰岛素是利用该技术生产的世界上第一个基因工程产品。目前上市的基因工程药物已百种以上。
利用重组 DNA 技术,可以让细菌、酵母等低等生物成为制药工厂,也使基因工程细菌成为各类生 物基因的储藏所;可以将小鼠杂交瘤细胞人源化,让其产生人源化抗体;可以制造基因工程病毒,使病毒保留免疫原性,缺乏感染性或变成不含核酸的类病毒颗粒(virus-like particle, VLP) 。
重组DNA技术是医学研究的重要技术平台
编辑重组 DNA 技术可用于医学研究的很多方面,诸如遗传修饰动物模型的建立、遗传修饰细胞模型的建立、基因获得或丧失对生物功能的影响等。
- 遗传修饰动物模型的医用研究 重组 DNA 技术可用于遗传修饰动物模型的研制,从而建立人类疾病的动物模型。目前已经建立了诸多人类疾病的遗传修饰动物模型,用于研究癌症、糖尿病、肥胖、心脏病、老化、关节炎等;遗传修饰猪模型的应用,可望增加从猪到人器官移植 (pig to human organ transplantation) 的成功率;改造蚊子的基因组,使其产生对疟疾的免疫反应,可望消灭疟疾。
- 遗传修饰细胞模型在医学研究中的应用 重组 DNA 技术也可用于遗传修饰细胞模型的建立,从而用于基因替代治疗/靶向治疗,或体内示踪。体细胞基因治疗(somatic gene therapy) 已经在 X-连锁联合免疫缺陷病(X-linked SCID)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lyrnphocytic leukemia,CLL)和帕金森病进行了临床研究,这是在人体上进行遗传工程的研究。改造 T 淋巴细胞,让其携带嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR), 从而达到靶向治疗疾病的 CAR-T 细胞也是采用重组 DNA 技术实现的。例如,人T细胞经基因操作成为靶向 CD19 的 CAR-T,用于治疗难治性慢性B淋巴瘤。将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 与细胞内的某些蛋白相融合,可使细胞变成具有示踪作用的发光细胞。
- 基因及基因功能的获得及丧失的研究 基因工程生物或细胞模型可用来发现一些基因的新功能,或发现新基因,一般可通过基因的获得(如转基因)或丧失(如基因敲除)进行研究,也可通过示踪实验(如 GFP 融合蛋白)研究基因表达产物的定位或相互作用信息等,或通过报告基因(如 GFP 或催化特定底物的酶)与不同启动子相融合的方法实现对基因表达调控的研究。
重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础
编辑重组 DNA 技术已经成为基因或基因功能获得或丧失研究的技术基础,也是基因表达产物相互作用研究的技术基础。
- 在基因组水平上干预基因 重组 DNA 技术是基因打靶(包括基因敲除和基因敲入)及基因组编辑等的技术基础。例如,基因敲除(gene knock-out) , 传统的方法是利用同源重组的原理,用目的基因替换基因组上的特定基因,要实现这一目标,需要将目的基因克隆到合适的载体上,并在其两侧加上待敲除基因上的部分序列,使重组 DNA 进入细胞后能通过同源重组替换基因组的目标基因。条件性基因打靶 (conditional gene targeting) 是在目的基因两侧构建了 Cre 重组酶的切割位点。基因组编辑(genome editing) 是指一类能定向地在基因组上改变基因序列的技术,其中 CRISPR/Cas9 系统是目前应用最多的、脱靶最少的基因组编辑技术,也是细菌抵抗病毒感染的一种获得性免疫机制。利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术对特定基因进行改造,也需要在体外构建含导向 crRNA (guide crRNA, gcrRNA) 和 Cas9 编码基因的重组载体,然后将这种重组载体导入受体细胞,才能实现在基因组水平定向地改变特定基因的目的。
- 在RNA水平上干预基因的功能 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi) 是通过干扰小 RNA (small interference RNA, siRNA) 与靶 RNA结合,从而阻止基因表达的方法。siRNA 可以直接采用化学法合成,也可以利用 DNA 克隆技术构建干扰小发夹 RNA, 即将编码 siRNA 反向互补序列和间隔序列(linker) 克隆入合适的载体,在细胞内转录合成干扰小发夹 RNA,实现 RNA 干扰目的。
- 研究蛋白质的相互作用 重组DNA技术也是蛋白质相互作用研究的技术基础。例如,酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)是利用分别克隆转录因子DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)和转录激活结构域(transcription activating domain, TAD)的融合基因,对DBD-融合蛋白和TAD融合蛋白的融合部分的潜在相互作用能力进行研究。