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生物信息學/Bowtie

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使用BOWTIE2進行短序列比對

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將短read與大基因組比對

  • 構成 TopHat、Cufflinks、Crossbow 和 Myrna 的基礎
  • 除非使用基因組 DNA 分離的短read，否則不會直接使用 Bowtie
  • 除了使用 bowtie-build 創建基因組序列索引文件

map常用的工具有bowtie/bowtie2, BWA,SOAP1/SOAP2等。這個問題又會被分成兩個問題，是基因組測序（DNA-seq）還是轉錄組測序(mRNA-seq)。其中的區別是對於真核生物而言，mRNA序列與DNA序列並不完全相同，在經歷了後剪切之後，成熟的mRNA可能是原基因的一部分，甚至順序及個別鹼基會產生變化。如果是mRNA測序，那map工作就會在DNA測序map的基礎上再多一步，map到轉錄組上去。所以最為流行的做法是，使用bowtie來map DNA測序，使用tophat來map RNA測序。

現在用於短序列比對的主流軟件是Bowtie和Bwa。Bowtie2主要用於將長度為 50〜1000bp的reads比對到基因組上，生成SAM格式的比對結果文件。Bowtie2將reads 比對到基因組，常常是很多分析的第一步。比如variation calling，ChlP-seq, RNA-seq 和 BS-seq 等。 Bowtie2 詳細的網頁說明文檔：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml。

相比於Bowtie1，Bowtie2的主要優點和特性有：

1.对于长度大于50bp的reads，Bowtie2更快更精确；而小于50bp的reads，Bowtie1常常更快更精确。
2.Bowtie2支持的reads长度没有上限，当然reads长度在50〜1000bp为宜;而Bowtie1支持的reads长度最长约为1000bp。
3.Bowtie2的比对支持gap，而Bowtie1不支持。
4.Bowtie2可以支持局部比对，而Bowtie1不支持。
5.Bowtie2的比对支持在参考序列中有N，而Bowtie1不支持。

Bowtie的下載和安裝

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使用conda安裝Bowtie1和Bowtie2

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conda install bowtie=1.1.2
conda install bowtie=2.3.0

直接安裝Bowtie的二進制包

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推薦直接下載Bowtie軟件的二進制包。

Bowtie1各版本下載地址

Bowtie2各版本下載地址

myrna各版本下載地址

crossbow各版本下載地址

# 安装 Bowtie1:
wget https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/bowtie-1.3.0-linux-x86_64.zip
unzip ~/software/bowtie-1.3.0-linux-x86_64.zip -d /opt/biosoft/
echo 'PATH=$PATH:/opt/biosoft/bowtie-1.3.0-linux-x86_64/' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

# 安装 Bowtie2
wget https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.4.4/bowtie2-2.4.4-linux-x86_64.zip -P ~/software/
unzip ~/software/bowtie2-2.4.4-linux-x86_64.zip -d /opt/biosoft/
echo 'PATH=$PATH:/opt/biosoft/bowtie2-2.4.4-linux-x86_64/' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

Bowtie的相關鏈接

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Bowtie2的使用

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創建Bowtie2的index數據庫

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使用Bowtie2進行序列的比對，首先要使用bowtie2-build來生成參考序列的索引數據庫。命令為：

bowtie2-build，默認情況下將fasta文件換成index的數據庫。

$ bowtie2-build --threads 4  <fastaFile文件> <要生成的索引文件前缀名Prefix>
Prefix为生成的数据库文件的前缀，也作为输入到bowtie2中的数据库名。

--large-index
加入该参数后，则使用较大的索引。一般情况下基因组大于4G的时候，考虑使用大索引。若索引越大，则索引的数目越少，构建索引的速度越快，索引文件也越小；但是，根据索引进行搜索的时候，需要在大索引中定位序列匹配位置更加耗时,从而增加比对时间。
--threads <int>
设置运行的线程数。

Bowtie2的用法和常用例子

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Bowtie2的用法：

bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]

Bowtie2的常用例子：

对参考序列构建index
$ bowtie2-build genome.fasta index

尝试使用前10000(1M)个reads进行比对，用于快速调查short reads的匹配率；
$ bowtie2 -u 10000 -p 4 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

使用24个线程进行比对，设定测序格式为Phred33,运行的插入片段长度在0~500:
$ bowtie2 -p 24 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

比对的sam结果中添加了read group信息
$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam 

常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果
$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]

Bowtie2的參數和算法

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必須參數：

-x <bt2-idx> 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后在环境变量 BOWTIE2_INDEXES 中制定的文件夹中搜寻。
-1 <m1> 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和 -2 <m2> 中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB_2.fq". 测序文件中的reads的长度可以不一样。
-2 <m2> 双末端测寻对应的文件2.
-U <r> 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的长度可以不一样。
-S <hit> 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。

(以下是可選參數：) 輸入參數：

-q 输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。
-qseq 输入的文件为QSEQ格式文件。
-f 输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。
-r 输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。
-c 后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，表示—ignore-quals也被选择了。
-s/--skip <int> input的reads中，跳过前<int>个reads或者pairs。
-u/--qupto <int> 只比对前<int>个reads或者pairs（在跳过前<int>个reads或者pairs后）。Default: no limit.
-5/--trim5 <int> 剪掉5'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).
-3/--trim3 <int> 剪掉3'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).
--phred33 输入的碱基质量等于ASCII码值加上33. 在最近的illumina pipiline中得以运用。最低碱基质量是“#”。
--phred64 输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。
--solexa-quals 将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以运用。Default: off.
--int-quals 输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如 40 40 30 40...。Default: off.

Bowtie2可以支持reads的全局比對和局部比對兩種模式，下面是這兩種模式的預設參數。當然，可以通過修改比對參數來替換其預設參數。Bowtie2默認使用全局比對模式。 –end-to-end模式下的預設參數。選擇–end-to-end參數相當於設定如下參數。

--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-end mode) 
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

--loca模式下的預設參數。選擇–local參數相當於設定如下參數。

--very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 
--fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 
--sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode) 
--very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

比對參數：

-N <int> 进行种子比对时允许的mismatch数. 可以设为0或者1. Default: 0.
-L <int> 设定种子的长度.
************************************************************
功能选项
给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法, 包括常数(C),线性(L),平方根(S)和自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数. 
例如: 
<func> 为 L,-0.4,-0.6 则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x
<func> 为G,1,5.4 则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)
************************************************************
-i <func> 设定两个相邻种子间所间距的碱基数。
************************************************************
例如：如果read的长度为30, 种子的长度为10, 相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下
所示：
Read:      TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC
Seed 1 fw: TAGCTACGCT
Seed 1 rc: AGCGTAGCTA
Seed 2 fw:       CGCTCTACGC
Seed 2 rc:       GCGTAGAGCG
Seed 3 fw:             ACGCTATCAT
Seed 3 rc:             ATGATAGCGT
Seed 4 fw:                   TCATGCATAA
Seed 4 rc:                   TTATGCATGA 
************************************************************
 在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 * sqrt(x). 如果read长度为100, 则相邻种子的间距为12.
--n-ceil <func> 设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目。
Default: L,0,0.15. 计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x, 表示长度为100的read最多运行存在15个不确定碱基。一旦不确定碱基数超过15, 则该条read会被过滤掉.
--dpad <int> Default: 15.
--gbar <int> 在read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4.
--ignore-quals 计算错配罚分的时候不考虑碱基质量. 当输入序列的模式为-f, -r 或者-c的时候, 该设置自动成为默认设置。
--nofw/--norc 	--nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;
--norc	设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对。 
Default: both strands enabled.
--end-to-end 比对是将整个read和参考序列进行比对。该模式--ma的值为0。该模式为默认模式, --local模式冲突。
--local 该模式下对read进行局部比对, 从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比对得分满足要求。该模式下 --ma默认为2.

得分罰分參數：

--ma <int> 设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配, 则加<int>分. 在--end-to-end模式中无效. Default: 2.
--mp MX,MN 设定错配罚分. 其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分。默认设置下罚分与碱基质量相关。罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) )。其中Q为碱基的质量值。如果设置了--ignore-qual参数, 则错配总是罚最高分。Default: MX = 6, MN = 2。
--np <int> 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值。Default: 1。
--rdg <int1>,<int2> 设置在read上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分<int2>。Default: 5, 3。
--rfg <int1>,<int2> 设置在reference上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分<int2>。Default: 5, 3。
--score-min <func> 设定成为有效比对的最小分值. 在—end-to-end模式下默认值为：L,-0.6,-0.6; 在--local模式下默认值为: G,20,8.

報告參數

-k <int> 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果, 并报告其中最好的比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致, 则随机挑选出其中一个)。而在该模式下，bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果, 并将这些结果按得分降序报告出来.
-a 和-k参数一样, 不过不限制搜索的结果数目。并将所有的比对结果都按降序报告出来。此参数和-k参数冲突。值得注意的是: 如果基因组含有很多重复序列时, 该参数会导致程序运行极其缓慢.

Effort 參數

-D <int> 比对时, 将一个种子延长后得到比对结果, 如果不产生更好的或次好的比对结果, 则该次比对失败. 当失败次数连续达到<int>次后, 则该条read比对结束。Bowtie2才会继续进行下去。Default: 15。当具有-k或-a参数, 则该参数所产生的限制会自动调整。
-R <int> 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多。当每个种子平均匹配超过300个位置, 则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对。<int>则是重新生成种子的次数。Default: 2。

Paired-end 參數

-I/--minins <int> 设定最小的插入片段长度。Default: 0。
-X/--maxins <int> 设定最长的插入片段长度。Default: 500。
--fr/--rf/--ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向。Default: --fr。
	--fr(==>>  <<==): 匹配时，read1在5'端上游, 和前导链一致, read2在3'下游, 和前导链反向互补。或者read2在上游, read1在下游反向互补。
	--rf(<<==  ==>>): read1在5'端上游, 和前导链反向互补, read2在3'端下游, 和前导链一致。
	--ff(==>>  ==>>): 两条reads都和前导链一致。
	默认设置适合于Illumina的paired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择—rf参数。
--no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进行比对。该选项则阻止此行为。
--no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment,即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(discon cordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,-X,--fr/--rf/--ff的条件)。该选项阻止此行为。
--dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对。默认情况下dovetail不算和谐比对.
--no-contain read1和read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对。默认情况下包含关系算为和谐比对.
--no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对。默认情况下两个reads重叠算为和谐比对。

輸出參數

-t/--time Print the wall-clock time required to load the index files and align the reads. Default: off.
--un <path> 将unpaired reads写入到<path>.
--un-gz <path> 将unpaired reads写入到<path>, gzip压缩.
--un-bz2 <path> 将unpaired reads写入到<path>, bz2压缩.

--al <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>.
--al-gz <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>,gzip压缩.
--al-bz2 <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>,bz2压缩.

--un-conc <path> 将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>.
--un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩.

--al-conc <path> 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>.
--al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩.

--quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西.

--met-file <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug. 
Default: metrics disabled.
--met-stderr <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上
一个选项不冲突. Default: metrics disabled.
--met <int> 每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.

Sam參數

--no-unal 不记录没比对上的reads.
--no-hd 不记录SAM header lines (以@开头).
--no-sq 不记录@SQ的SAM header lines.
--rg-id <text> 设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG，在输出的SAM文件中添加Tag "RG:Z:text"。
--rg <text> 使用text作为@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，则多次使用该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头，SM信息和Tag RG。

性能參數

-o/--offrate <int> 无视index的offrate值, 以<int>取代之. Index默认的<int> 值为5. <int>值必须大于index的offrate值, 同时<int>越大, 耗时越长，耗内存越少.
-p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1
--reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选项, 则使其一致.
--mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie程序共用内存中同样的index, 节约内存消耗.

其它參數：

--qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0的reads. 仅当有—qseq选项时有效. Default: off. 
--seed <int> 使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.
--version 打印程序版本并退出
-h/--help 打印用法信息并退出

Bowtie2的結果文件

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Bowtie2輸出的比對結果文件為SAM格式，同時在比對完畢時，將比對的統計結果輸出到標準錯誤輸出。

有關於SAM格式的介紹請見本章第4節。Bowtie2生成的SAM格式中，最後一列 Tags的一些說明如下：

AS:i:<N> 比对得分。该值可以是负数，在--local模式才可以是正数。
XS:i:<N> Read的最佳比对结果的得分，而不一定是当前比对记录的得分。当reads比对到参考序列多个位点时，才出现此tag。

Bowtie2 practice

編輯 
bowtie2-build --threads 4 genome.fasta genome
bowtie2 -p 4 -x genome -1 V1.1.fastq -2 V1.2.fastq -S V1.sam 2> V1.bowtie2.log
bowtie2 -p 4 -x genome -1 V2.1.fastq -2 V2.2.fastq -S V2.sam 2> V2.bowtie2.log
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