生物化学与分子生物学/PCR实验技术/RFLP操作步骤

一、实验目的

学习和掌握限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

遗传标记的基本原理和检测方法。

二、实验原理

第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。

三、仪器、材料与试剂

1. 仪器： 电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
2. 材料与试剂：Hind Ⅲ 限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。

四、实验步骤

• Hind Ⅲ 限制性内切酶酶切

反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：

10xM buffer	1 μL
ddH2O	5.5 μL
Hind Ⅲ	0.5 μL
PCR产物	3  μL

37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。

• 琼脂糖凝胶电泳

配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V恒压电泳。DNA带负电荷，电泳时DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。