生物化学与分子生物学/DNA实验技术/动物基因组DNA的提取
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实验原理
编辑在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于L嘴菌体构建基因组文库和 Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。
仪器、材料与试剂
编辑仪器
编辑- 台式离心机
- 玻璃匀浆器
- 高压灭菌锅
- 恒温水浴
材料
编辑- 1.5mL微量离心管
- 微量取样器和吸头
- 无菌过滤器(一次性)
- 10 mL注射器
- 鼠肝
- 三羟甲基氨基甲烷(Tris)
- 十二烷基硫酸钠(SDS)
- 乙二胺四乙酸(EDTA)
- 蛋白酶K
- RNA酶
- DNA相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物
试剂
编辑1.5 mol/L NaCl | |
0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0 | |
0.5 mol/L EDTA pH8.0 | |
3 mol/L NaAc pH5.2 | |
以上均高压灭菌。 | |
蛋白酶K | 10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20℃保存 |
组织匀浆液 | 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0) |
酶解液 | 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS |
无DNA酵的RNA酶 | 将胰RNA酶溶解于10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L NaCl溶液中,浓度l0mg/mL,于100℃水浴处理15min,以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存 |
TE缓冲液 | 10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0) |
平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1 (体积比) | 氧仿,异戊醇=24:1 (体积比) |
5xTBE | 5.4gTris,2.75g硼酸 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL; |
6x上样缓冲液 | 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液 |
λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP) | 21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125 |
实验步骤
编辑本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下降。整个操作过程中,应尽量避免DNA酶的污染,特g4注童动作温和,减少对DNA的机械捌伤。
- 取0.2g鼠肝,用冰冷的生理盐水洗3次,然后置于2.0mL匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。
- 将组织细胞移至1.5ml离心管中,50000rpm离心30-60sec,(尽可能在低温下操作),弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入1倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
- 沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散,分两管,再加0.4mL酵解液,翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h;
- 沉淀加RNase至终浓度200µg/mL,37℃水浴1 h;
- 加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心;
- 有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、
- 10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复1.6操作)。
- 用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心混匀(要充分),再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20 过夜。
- 12 000rpm离心19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm离心15min室握温干燥(不要大干,否则DNA不易溶解),加入适量TE缓冲液,存放于4℃,轻摇溶解过夜,即可得 到实验动物基因组DNA。
- 电泳鉴定DNA,由于基因组DNA相对分子质量较大,用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,先在底部锦一层1%的支持胶,凝固后再铺上一层0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾到的支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准),观察基因组DNA大小,用溴化乙锭染色观察结果。
注意事项
编辑- 操作过程尽量在低温下进行,避免DNA降解。
- 琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。
- 提取得到的基因组DNA应为单一条带,DNA降解可形成弥散带型。