细胞生物学/B淋巴细胞分离技术

B淋巴细胞分离技术 编辑

实验原理 编辑

膜表面免疫球蛋白(SmIg),是B细胞特有的表面标志,它既是B细胞识别抗原的受体,与相应抗原特异性结合;又是表面抗原,能与相应的抗Ig的抗体结合,故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检,以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg,所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM,以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG的Fc段发生结合,并且这种反应也发生于膜表面的IgG,所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞,凡于FITCSPA结合的细胞,在荧光显微镜下,可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体,即为SmIg阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下:

实验材料 编辑

1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂,用时按要求稀释。

2 pH值72 Hanks液,含5%小牛血清。

3 淋巴细胞分层液,20℃时比重为1077±0002

4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片

实验步骤 编辑

1、取肝素抗凝血2ml,用Hanks液稀释1~2倍,轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中,2000~2500 r/min水平离心20~25min,获取淋巴细胞。

2、用pH值7.2Hanks液洗2次,最终配成细胞数为2~25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂,然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合,充分混匀后,放4℃冰箱30min。

3、再用经37℃预热的Hanks液(含5%小牛血清)洗涤离心

4、取沉淀细胞滴加在载玻片上,覆以盖玻片,在荧光显微镜下观察。

结果观察 编辑

凡淋巴细胞表面粘附5个以上菌体细胞为SmIg阳性。一般先用暗视野计算荧光阳性细胞数,继用明视野计算同一视野中淋巴细胞总数。每份标本至少计算200个淋巴细胞,并求出荧光阳性细胞百分率,同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。同时,每个B淋巴细胞表面可带有不同类别的Ig,即IgM、IgG、IgA等,如果分别用单价荧光抗Ig血清染色,则可鉴定不同Ig的B淋巴细胞。但淋巴细胞数量的多少会影响检出率。过多或过少时,除难以计数外,染色背景明暗不匀,着色与不着色的细胞难以区别,一般以2~25×106/ml细胞浓度为宜,活细胞数应不少于95%。

实验分析 编辑

此法特异性强,荧光亮度好,操作迅速简便。加上试剂有商品供应,可以使本法标准化。

一般SmIg阳性的B淋巴细胞表面或周围均可布满许多黄绿色荧光菌体,很少见到表面只粘附2~3个菌体细胞同时,每个B淋巴细胞表面可带有不同类别的Ig,即IgM、IgG、IgA等,如果分别用单价荧光抗Ig血清染色,则可鉴定不同Ig的B淋巴细胞。

淋巴细胞数量的多少会影响检出率。过多或过少时,除难以计数外,染色背景明暗不匀,着色与不着色的细胞难以区别,一般以2~25×106/ml细胞浓度为宜,活细胞数应不少于95%。

实验注意事项 编辑

当SmIg抗体发生结合时,由于抗血清为双价,使SmIg出现交联现象,这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状,时间过长,帽状结合物可脱落或被吞饮而消失,因此染色后,观察时间不能超过30min,或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。

在滴片前要彻底去除游离的抗体,以避免假阳性结果

备注 编辑

异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4,最大吸收光波长为490~495nm,最大发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。