細胞生物學/T淋巴細胞分離技術

T淋巴細胞分離技術

免疫細胞的分離、純化技術

各種免疫細胞的分工與協作，共同完成免疫應答及其調控，因此，各種免疫細胞的分離及其功能測定對於了解其在免疫應答中的作用及相互關係有著重要意義。免疫細胞分離的方法有很多，主要是根據細胞的理化性狀、功能，以及細胞表面標誌等的差異而設計的。粘附分離法、尼龍毛柱分離法、羰基鐵分離法等主要根據細胞的屬性（如粘附）和功能不同，旨在將粘附和非粘附或粘附力較小的細胞分離開。有人證實免疫細胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分別為：巨噬細胞或單核細胞＞樹突狀細胞=抗體產生細胞＞B淋巴細胞＞T淋巴細胞=紅細胞。粘附的細胞可通過trypsin洗脫而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法和Percoll不連續密度梯度離心法等是根據細胞的大小及比重的差異進行細胞分離。E花環沉澱分離技術主要是利用細胞表面標誌進行細胞分離。尚可利用特異性單株抗體結合其它技術分選細胞，如補體細胞毒分離法，洗淘分離法（panning）、流式細胞術分離法，以及免疫磁珠法分離細胞技術等。一般應根據實驗的目的及所需細胞的種類、純度及數量等要求來確定採用何種方法。

Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（PBMC）

外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分離是免疫學研究中的一項基本技術。目前國內外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達95％，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％，B淋巴細胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細胞分層液，在分離人PBMC時，要求其比重為1.077；分離小鼠單個核細胞時比重為1.080；分離大鼠單個核細胞時比重為1.084～1.087；分離馬單個核細胞時比重為1.090。

原理

血液中各有形成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近於等滲的ficoll-hypaque混合溶液（又稱淋巴細胞分層液）作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由於密度較低，故懸浮於分層液的上部；紅細胞與粒細胞由於密度較大，故沉於分層液的底部；PBMC密度稍低於分層液，故位於分層液界面上，這樣就可獲得PBMC。

器材與試劑

1.刻度離心管、吸管、試管、毛細吸管、橡皮乳頭、載玻片、蓋玻片、離心機等。

2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理鹽水溶液，淋巴細胞分層液。（8.2%的聚蔗糖溶液28份，35.7%泛影葡胺10份）

方法

1.靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液或生理鹽水將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細胞分層液置於刻度離心管中，然後將離心管傾斜45O角，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應注意保持兩者界面清晰。

3.在18℃～20℃下，用水平離心機以2000r/min離心20min。離心後細胞分布如圖。

4.用毛細吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個核細胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細胞成分。

5.用Hanks液洗滌細胞3次。第一次2000r/min ，10 min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉澱細胞懸於培養基中備用。

注意事項

1、實驗所用玻璃器皿應該潔淨。如果製備的單個核細胞懸液用於細胞培養時，上述操作過程都要在無菌條件下進行，所用器材、試劑都應為無菌。

2、實驗中的細胞得率與室溫及分層液比重等有關。分層液應避光4℃保存。

3、往淋巴細胞分層液中加入稀釋全血時，不得將血液沖入分離液中，須保持兩層液體的清晰界面。

免疫磁珠法分離淋巴細胞

原理

免疫磁珠法分離細胞是基於細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由於不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。

根據免疫磁珠（immune magnetic bead，IMB）的種類，免疫磁珠法分離細胞可分為直接法和間接法。直接法即將特異性抗體與磁珠相連，IMB可與表達相應膜抗原的細胞結合，在磁性分離器（磁架）作用下，連有磁珠的細胞被吸附在磁架上，從而與其他細胞分離。間接法即將二抗與磁珠相連，磁珠通過二抗與一抗相結合，一抗與細胞表面抗原結合，因此使磁珠與細胞相連，從而在磁場作用下，對細胞進行分離。直接法分離得到的連有磁珠的細胞可直接用於功能實驗或流式細胞儀檢測。間接法分離得到的連有磁珠的細胞須再培養2天，待磁珠從細胞上脫落下來，才能進行功能實驗或流式細胞儀檢測。近年來，開發了生物素標記的單抗--親和素/鏈霉親和素—生物素結合的磁珠實驗體系（BAB法）。利用生物素和親和素之間的高親和力及生物放大效應來增強IMB與細胞的特異性結合，從而提高細胞分離效率。為了分離後迅速進行分離效果分析，目前有研究者將螢光素（如FITC）標記在親和素/鏈霉親和素表面，使所分離的細胞在流式細胞儀上馬上得到檢測，從而省去了免疫螢光染色的時間。

根據磁珠結合的細胞與所要獲得的細胞的關係，免疫磁珠法分離細胞可分為正選法和負選法。正選法即磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞，負選法即磁珠結合不需要的細胞，游離於上清液的細胞為所需細胞。還有一種基於負選法的高效分離方法，即在實驗體系中加入連接有磁珠的多種單抗，通過磁性分離器後，則所有不需要的細胞被吸附在磁架上，未被吸附的細胞為目的細胞。這種方法可一次去除多種細胞，又稱雞尾酒法（cocktail）。

免疫磁珠法分離細胞是一種90年代初興起的新型細胞分離技術，所獲細胞純度高（93%-99%），獲率可達90%，活細胞率大於95%，且操作簡單，不需使用離心沉澱分離技術，省時且費用低。

以下介紹免疫磁珠間接法分離淋巴細胞（正選法）（以Immunotech公司產品為例）。

器材與試劑

連接有磁珠的二抗，抗體（一抗）、PBS+0.2%BSA、PBS+1.2%BSA、PBS+30%FCS、磁架、玻璃管等。

方法

1．取適量磁珠懸液，用20倍體積的PBS+0.2%BSA溶液重懸後，置磁架上5min。（磁珠與單個核細胞或全血的比例為：0.5mg磁珠/1×107個單個核細胞或1ml全血）

2．吸去上清，以去除在儲存過程中從磁珠上脫落的二抗。用100ul PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。加入一抗（一抗與磁珠的比例為：5ug一抗/1mg磁珠），置室溫15 min，中間輕微晃動二次。再置磁架上5min。

3．加入2ml PBS+1.2%BSA溶液，再置磁架上5min。吸去上清，以去除未與二抗結合的一抗。重複操作一次。用100ul PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。

4．用PBS+30%FCS調整待分離細胞的濃度為1×107細胞/ml，將細胞加入磁珠懸液中，置室溫10min，中間輕微晃動一次。然後置磁架上10min。吸去上清。

5．用完全培養基重懸磁珠結合的細胞後直接進行培養。

注意事項

1．若採用負選法分離細胞，磁珠與細胞比例為：1mg磁珠/1×107單個核細胞或1ml全血。

2．待分離的細胞懸液應儘量是單細胞懸液，避免細胞粘附成團，以免影響分離效果。

血清滅活處理步驟

① 選用與血清瓶同規格的對照瓶一個。

② 對照瓶內放入與血清等體積的水。

③ 溫度預試：

　　對照瓶內插入2—3支經挑選的溫度計(保證測試溫度的準確性)，放入水浴箱中，接 通電源，調節溫度控制鈕，使水浴箱溫度所示溫度保持在56℃。

④ 血清滅活：血清瓶與帶溫度計的對照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計所示溫度上升至56℃時， 定時30分鐘。

⑤ 大瓶血清滅活後，進行分裝

⑥保存分裝後，抽樣做無菌試驗，－20～－70℃保存。

血清的熱滅活是很多培養者感興趣的話題，價格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，胺基酸等珍貴物質，而將它們置於50℃以上的溫度長達30分鐘是完全沒有必要的。儘管如此，在大多數實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規來執行，多數實驗者並沒有考慮熱處理對血清中的生長因子，胺基酸等成分帶來的負面影響，在我們的技術熱線中最常被提到的就是否該對血清進行熱滅活。