細胞生物學/細胞原代培養、傳代培養、凍存和復甦
細胞原代培養、傳代培養、凍存和復甦 編輯
實驗原理 編輯
細胞培養可分為原代培養和傳代培養。直接從體內獲取的組織細胞進行首次培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度後，則需要做再培養， 即將培養的細胞分散後，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞凍存及復甦的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多採用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質能提高 細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由於冰晶形成造成的細胞損傷。復甦細胞應採用快速融化的方 法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。
實驗方法 編輯
材料 編輯
小鼠，生理鹽水，100ml滅菌燒杯，15ml離心管，培養皿，滴管，無菌鑷子、剪刀，篩網，泡沫板，大頭針，酒精燈，培養瓶，培養 液，PBS，0.25%胰酶，超淨工作檯、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡，顯微鏡，計數板，離心機，恆溫水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，凍存管，凍存液，廢液缸等。
方法 編輯
（1）原代培養：
1.取出小鼠後瀝乾酒精，放入超淨台內，固定在泡沫板上。
2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口，將皮膚向上撕開，然後剪開肌肉等，暴露出腹腔，在左側找到脾臟，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置於無菌培養皿中。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次，並剔除多餘無用的組織。
4.將篩網置於平皿中，脾臟置於篩網上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網上進行碾磨，同時不停滴加不含血清的培養液沖洗。
5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中，離心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培養液，吹打混勻，取樣計數。
7.將稀釋好的細胞懸液分裝於培養瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養瓶上。
面做好標誌，註明細胞、組別及日期。然後將培養瓶置於二氧化碳培養箱中培養。
（2）傳代培養：
1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代。
2.培養液瓶打開後，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍。
3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過火，放入培養液瓶中。
4.打開培養瓶，瓶口過火，將培養瓶內的培養液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養基。
5.培養瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄蓋滿一層為宜，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脫離胰酶，然後將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養基。
6.取彎頭滴管反覆吹打細胞使其脫壁並分散，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養基，製成細胞懸液，然後分裝到新培養瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊後再稍迴轉，以利於CO2氣體的進入，將培養瓶放回CO2培養箱。
7.對半貼壁培養細胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養基，然後分裝到各瓶中。
（3）凍存：
1.吸取傳代後的細胞懸液，離心，去除培養液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內細胞數目一般為（5～10）×106個/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）。
2.按步凍存
o冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。
o冷凍保存方法二：冷凍管置於已設定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。
（4）復甦：
1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，移入無菌操作台內。
2.打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
3.1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
4.加適當培養液後將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。
實驗結果計算 編輯
1.一隻小鼠可獲得（1～2.5）×108個脾細胞。
2.細胞接種後一般幾小時內就能貼壁，並開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
3.一般情況，傳代後的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。
注意事項 編輯
1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。
2.沖洗脾臟時要儘量洗淨血污，去除無用組織，並要防止組織乾燥。
3.碾磨後及時用清水沖洗篩網，防止組織、細胞阻塞網孔。
4.計數前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞。
5.實驗操作應在操作台中央無菌區域內進行，勿在邊緣非無菌區域操作。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，燒過的金屬鑷要待冷卻後才能挾取組織，以免造成組織損傷。
7.另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。
8.吸取過營養液後的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。
11.換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。
12.吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。
13.手或相對較髒的物品不能經過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。
14.每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。
15.注意自身的安全，對於來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑例如DMSO，並避免尖銳物品傷人等。
16.從增殖期到形成緻密的單層細胞以前的培養細胞都可以用於凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液。
17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。
18.凍存和復甦最好用新配製的培養液。