細胞生物學/細胞凋亡檢測方法

細胞凋亡檢測，細胞凋亡實驗步驟，檢測方法

定性和定量研究

只定性的研究方法：常規瓊脂糖凝膠電泳、脈衝場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、螢光顯微鏡）

進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

區分凋亡和壞死

可將二者區分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態學觀察（透射電鏡是是區分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細胞儀檢測等。

不能將二者區分開的方法：原位末端標記法、PI單染色法流式細胞儀檢測等。

樣品來源不同選擇

組織：主要用形態學方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記，ELISA或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

細胞凋亡檢測

早期檢測:

1) PS(磷脂醯絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測

3)細胞色素C的定位檢測

4) 線粒體膜電位變化的檢測

晚期檢測：

細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。

對於晚期檢測通常有以下方法：

1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)

2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

生化檢測：

1）典型的生化特徵：DNA 片段化

2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等

3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）

4）通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3』-OH端，再通過酶聯顯色或螢光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA後，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然後進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特徵，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。

其它方法

Telemerase Detection (端粒酶檢測)

端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重複序列，使細胞獲得「永生化」。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、複製衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。

mRNA水平的檢測

研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報導，Fas 蛋白結合受體後能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用螢光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

細胞內氧化還原狀態改變的檢測

正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩衝劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

細胞色素C的定位檢測

細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）後啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1複合物激活caspase-9，後者再激活caspase-3和其它下游caspase。

線粒體膜電位變化的檢測：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關係

2）近年來陸續有報導說明線粒體跨膜電位的耗散早於核酸酶的激活，也早於磷酯醯絲氨酸暴露於細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由於線粒體內膜的通透性轉變，這是由於生成了動態的由多個蛋白質組成的位於線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。

線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，並不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。

2）形態學觀察，看到細胞數目有限，統計學上的準確性受影響；

3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例；

4）流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特徵性變化。

用於流式細胞儀檢測的染料

PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。

PI和Hoechst33342雙標：

PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的螢光染料，故細胞在處於壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由於濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。

故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。

PI和Annexin-V雙標

磷脂醯絲氨酸（PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時）PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂醯絲氨酸（PS）特異性結合。因此細胞處於調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性

形態學觀察

• 普通光學顯微鏡觀察
• 透射電子顯微鏡觀察
• 螢光顯微鏡觀察

普通光鏡下觀察

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色

直接用倒置顯微鏡觀察：

1）細胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

透射電子顯微鏡觀察

凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。

細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

螢光顯微鏡

常用的螢光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色螢光。

1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的螢光強度要比正常細胞中要高。

DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。

碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

注意事項：細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標誌之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

細胞凋亡的分子生物學檢測方法

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然後大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3』-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和螢光素、過氧化物酶、鹼性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3』-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3』-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離後，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然後分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特徵，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛採用。

過氧化物酶標記測定法

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，並可與連接了報告酶（過氧化物酶或鹼性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去後，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。

本方法可以用於福馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。

試劑配製

1、磷酸緩衝液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩衝液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩衝液 98.0ml。

4、TdT酶緩衝液（新鮮配）：Trlzma鹼 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩衝液 76μl，混勻，置於冰上備用。

6、洗滌與終止反應緩衝液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml

7、0.05％二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾後，加過氧化氫至0.02%。

8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。

9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）

實驗步驟

1、標本預處理：

（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置於染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），於室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然後按下述步驟2進行操作。

（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，於室溫固定10min後，去除多餘液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，於-20℃處理5min，去除多餘液體。用PBS洗兩次，每次5min，然後按下述步驟2進行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞於 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液並使之乾燥。用PBS洗兩次，每次5min，然後按下述步驟2進行操作。

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，於室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多餘液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩衝液，置室溫1～5min。

4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多餘液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中於37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5、將切片置於染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩衝液，於37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、 組織切片用PBS洗 3次，每次 5min後，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，於濕盒中室溫反應30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最後1次5min。

10、 於室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最後1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、乾燥後，在光學顯微鏡下觀察並記錄實驗結果。

注意事項

一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其餘步驟與實驗組相同。

吖啶橙(簡稱AO)螢光染色法

原理：吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一種螢光染料，激發峰492nm，螢光發射峰530nm(DNA)，640nm(RNA)，它與雙鏈DNA的結合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光(給502nm)激發下，細胞核發亮綠色螢光(約530nm)，核仁和胞質RNA發桔紅色螢光(＞580nm)。吖啶橙的陽離子也可以結合在蛋白質、多糖和膜上而發螢光，但細胞固定阻抑了這種結合，從而主要顯示DNA、RNA兩種核酸。

試劑

AO貯備液：

AO 50mg(分析純)

蒸餾水 50ml

4℃冰箱保存4個月。

Tris緩衝液：

Tris 50mmol/L

MgCl2 2.5mmol/L

KCl 25mmol/L

AO工作液：

將AO貯備液10:1用蒸餾水稀釋，再用Tris緩衝液將AO稀釋到8.5μg/ml的終濃度。

操作步驟

①取乙醇固定的細胞懸液，濃度為107/ml，1500r/min，5分鐘，棄乙醇。

②加入2ml AO工作液，室溫染10分鐘。

③滴在載玻片上，加緩衝甘油封片。

④在螢光顯微鏡下用吸收波長405nm，發射波長530-640nm觀察。

結 果：活細胞核呈黃綠色螢光，胞質呈紅色螢光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

Hoechst33258染色

Hoechst33258為特異性DNA染料，，與A-T鍵結合，但在pH2.0環境下則優先與RNA結合，染色DNA時應調整染液的pH至7.0，這種染料不溶於磷酸緩衝液；所以配製時必須先以蒸餾水溶解配成儲存液在4℃中避光保存。

本方法是用於培養細胞、細胞塗片或細胞甩片。

試劑及配製

(1)Hoechst33258貯存液：稱取Hoechst33258試劑1mg，用20ml蒸餾水溶解後，濾過，4℃避光保存。用時蒸餾水10倍稀釋成染色液。

(2) 0.01molPBS，pH7.2。

(3)封片液(pH5.5)：20mmol/L檸檬酸，50mmol/L 磷酸氫二鈉，50%甘油。

(4)細胞固定液：甲醇/冰乙酸(3:1)，現配。

操作方法

(1)原代細胞培養、細胞學塗片或細胞甩片機制製備的單細胞片。

(2)細胞固定液4℃固定5min。

(3)蒸餾水稍洗後，點加Hoechst33258染色液，10min。

(4)蒸餾水洗片後，用濾紙沾去多餘液體。

(5)封片劑封片後螢光顯微鏡觀察。

結果：在螢光顯微鏡下，活細胞核呈彌散、均勻螢光，壞死細胞不被Hoechst染色。出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染緻密的顆粒塊狀藍色螢光及明顯核形態變化，如果見到3個或3個以上的DNA螢光碎片被認為是凋亡細胞。

甲基綠-派諾寧染色法

原理

細胞凋亡和細胞壞死均可表現為細胞核固縮等細胞死亡形態，但兩者發生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內蛋白酶的激活，細胞質內常有mRNA表達的增強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程，細胞質內常有RNA的損失。根據這一特點，可應用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質核心糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞。

試劑及配製

1. 組織固定液

無水乙醇 600ml

氯仿 300ml

冰醋酸 100ml

2.甲基綠純化 新購買的甲基綠需用氯仿進行純化處理以去除甲基紫。方法是將2％甲基綠水溶液20ml傾入潔淨分液漏斗，加入氯仿20ml充分，使其內的甲基溶於氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶比紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反覆更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4℃保存。

3.染色液

甲基綠貯存液 5ml

5%派諾寧水溶液 1ml

蒸餾水 12ml

0.2mol/L乙酸鈉(pH4.8) 18ml

臨用前配製，濾紙過濾。

操作方法

1.新鮮取材組織置固定液中4℃固定3-6h(或培養細胞、細胞學甩片固定10min)。

2.直接轉入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

3.切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水。(細胞學塗片不用梯度酒精)

4.置染色液中室溫下染色約1h。

5.取出切片，不經水洗，用濾紙吸乾多餘染液。

6.插入丙酮中迅速分化。

7.轉入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。

8.二甲苯透明2-3次。

9.中性樹膠封固。

結果

光學顯微鏡下凋亡細胞固縮，細胞核呈綠色或綠藍色著染，胞質呈紅紫色著染，壞死細胞只有固縮細胞核呈綠色著染。觀察時可用凋亡指數進行計數，即隨機選擇約10-20個視野(每張切片約1000-2500個細胞)，計數凋亡細胞百分率。

TdT介導的dUTP缺口末端標記技術(TUNEL)

原理：在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特徵為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚，時間也很短暫。凋亡的特徵是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，並產生與DNA斷點數目相同的3?ˉ-OH末端。

末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)可以將地高辛標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至3』-OH末端，DIG-dUTP(核苷酸)結合在DNA斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應後，再結合鏈酶親和素-過氧化物酶(SABC)，然後加入顯色底物DAB予以顯示。凋亡的細胞核呈棕黃色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。

試劑

1.標記緩衝液(Labeling Buffer)

5×濃度的TdT反應緩衝液，含有以下成分：

500mmol/L二甲胂酸鉀。pH7.2

10mmol/L CoCl2 (氯化鈷)

1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)

2.末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)

3.DIG-dUTP(×20)

4.封閉液(Blocking Reagent)

5.生物素化抗地高辛抗體(×100)

6.SABC(×100)

7.ProteinaseK(×200)

8.抗體稀釋液

9. 多聚賴氨酸或APES。

10. 0.01M TBS,PH7.5(配法：1L雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉，1.2克Tris和0.45-0.5ml純乙酸。)

11. DAB顯色試劑。

操作步驟

1.樣品處理

(1)玻片預先用多聚賴氨酸或APES進行處理。

(2)細胞塗片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)室溫下固定30-60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。

(3)組織：有條件時應及時固定。常規4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)或10%中性緩衝福馬林固定4小時以上，石蠟包埋。切片常規脫蠟入水(脫蠟務必乾淨)。

2.新鮮配製3%H2O2，室溫處理10分鐘。蒸餾水洗滌2分鐘×3次。

3.標本片加0.01M TBS1:200新鮮稀釋Proteinase K37℃消化5-15分鐘，0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細胞塗片和冰凍切片一般不消化或消化10-60秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-30分鐘)。

4.標本片加標記緩衝液(Labeling Buffer)20μl/片，以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl標記緩衝液中，混勻。甩去切片上多餘液體後加標記液，20μl/片。置樣品於濕盒中，37℃標記2小時。

5.0.01M TBS洗2分鐘×3次。

6.加封閉液50μl/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

7.用抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μl)，混勻後50μl/片加至標本片上。置樣品於濕盒中，37℃反應30分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。

8.用抗體稀釋液1:100稀釋SABC：取1ml抗體稀釋液加SABC10μl，混勻後50μl/片加至切片。37℃反應30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。

9.DAB顯色。

10.蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

結果判定細胞核固縮有的呈碎片狀，不規則，大小不一致，呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。 即凋亡的細胞

TUNEL改良方法在細胞凋亡檢測中的應用

材料和方法

材料

取手術下新鮮組織，恆冷切片5μm，4%多聚甲醛緩衝液固定4-8小時，載玻片用APES處理，同時連續切片、1%火棉膠、0.01MPpH7.4PBS、3%H2O2、1.0M枸櫞酸鹽緩衝液、通透液(0.1%Triton-100、0.1枸櫞酸鈉)、標記緩衝液(pH6.8)：二甲胂酸鈉100mmol/L標記、二巰基蘇糖醇0.1mmol/L，氯化鈷(coci)。

* TdT反應液；標記緩衝液(pH6.8)中加TdT酶100U/ml，biotin-dUTP；鏈黴菌素標記的辣根過氧化物酶，蛋白酶K(20μg/ml)。

* 顯色劑 氨乙基咔唑(amino ethyl carbazole,AEC)的 配製

AEC 20mg

二甲醯胺DMF 2.5ml

0.05M醋酸緩衝液(pH5.5) 50ml

0.3%H2O2 0.5ml

實驗步驟

（1）切片用冷風吹乾後為防止冰凍切片脫片用1%火棉膠封片1分鐘，PBS漂洗3×5分鐘；

（2）3%H2O2阻斷10分鐘後PBS洗3×5分鐘；

（3）組織切片浸泡於盛有1.0mol/L枸櫞酸鹽緩衝液的燒杯中，置於微波爐內，在650W，輻射時間15min的條件下進行組織處理。冷卻至室溫。

（4）放在通透液（0.1%Triton -100溶於0.1%枸櫞酸鈉溶液）中室溫20分鐘，PBS漂洗3×5分鐘；

（5）滴加50μl TdT反應液37℃1h，PBS漂洗3×5分鐘；(6)滴加50μl biotin-dUTP，反應液37℃1h，PBS漂洗3×5分鐘；(7)滴加50μl鏈黴菌標記辣根過氧化物酶液37℃孵育30分鐘，(8)PBS漂洗3×5分鐘， AEC-H2O2顯色10-15分鐘，蘇木素復染(用1%的酸性水分化)，水洗、水溶性封片。陽性對照dTd反應前用20μg/ml蛋白酶K處理切片。陰性對照用PBS代替dTd反應液。

結果判斷及標準

改良的方法：凋亡細胞核呈紅色固縮，有白邊集或碎列，細胞膜皺褶，有的捲曲和出泡，在計數時避開壞死區域，以避免假陽性。計數500個細胞中的凋亡細胞數目，得出凋亡百分率。凋亡染色分度如下：每個高倍視野平均1-3個為Ⅰ級；3-6個為Ⅱ級；6-10個為Ⅲ級；>10個者為IV級。陽性對照：經在dTd反應認前用20μg/ml蛋白酶，處理切片30分鐘的切片同改良方法基本相同，但紅色較淺。陰性對照：切片無棕色反應。

評價

正常的或正在增殖的細胞沒有DNA的斷裂，沒有3』-OH末端被標記，因此鏡下無顯色的物質。這種分子生物學與形態學相結合的方法，可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行標記，準確反應細胞凋亡最典型的生物化學與形態學特徵，靈敏度遠遠高於一般的組織化學和生物化學方法。在檢測過程中，可設陰性對照(不加TdT)陽性對照(已知的陽性標本)。

注意:AEC孵育切片，反應產物為紅色。可用蘇木精對襯染色，反應產物是純酒精溶性的，因此。可用酸性水溶液分化，然後用水溶性封固劑封片。

凋亡細胞：凝膠電泳檢測

前已提及凋亡細胞的突出特徵是由於內源性核酸內切酶的激活而導致細胞核DNA的斷裂。典型的細胞凋亡，在核內形成大量200bp大小及其倍體的核苷酸片段，而非典型的凋亡細胞，由於核內的DNA降解不完全，僅形成300~50kb的DNA大片。利用這一特性，可通過DNA凝膠電泳來判定凋亡的發生和發展情況。

試劑

1. PBS緩衝液

2. 消化液的配製：

100mmol/L NaCl

10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

25mmol/L EDTA(pH8.0)

0.5%SDS

0.2mg/ml蛋白酶K

3. 酚：氯仿：異戊醇混合液按25:24:1比例配製。

4. 氯仿：異戊醇混合液按24:1比例配製。

5. 醋酸銨，7.5mol/L。

6. 100%和70%的乙醇。

7. TE 緩衝液(pH8.0)：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA。

8. TBE緩衝液。

9. 電泳儀。

10. UV透射儀。

11. 照相設備。

12. 不含DNA酶的RNA酶。

13. 2%凝膠的配製：取凝膠粉2g，溶於100ml 0.5倍的TBE緩衝液中，加熱至沸騰，攪拌使其均勻。待凝膠溫度降至50℃時，倒入模板待其凝固。

14.溴化乙啶(EB)：10mg/ml水溶液。

15.DNA分子量標準物(Bio-Rad Lab，hercules,CA,USA)。

操作步驟

1.培養的懸浮細胞經離心(300g，5min)去上清液後，用冷(4℃)PBS緩衝液洗滌二次；培養的貼壁細胞經用胰蛋白酶消化後收集，同樣方法洗滌二次，離心並去掉上清，僅留細胞沉積物。

2.向細胞沉積物中加入消化液，混勻後，於50℃孵育12-16h。

3.用酚：氯仿：異戊醇混合液抽提一次，再用氯仿：異戊醇混合液抽提二次。其中每次加入抽提液後混勻5min，然後以3600g離心5min，吸取抽提物。

4.向抽提物中加入 醋酸銨，至終濃度為2.5mol/L，混勻後，加入二倍體積的100%乙醇，4℃下靜置2h。

5.將抽提物以12000g在室溫下離心30min，棄去上清。

6.用70%乙醇重複上述步驟，洗滌一次，棄去上清。

7.真空抽乾或空氣乾燥DNA抽提物。

8.將提取的DNA用TE緩衝液溶解。

9.取10μl溶於TB液的DNA抽提物，加入0.1U的無DNA酶的RNA酶，於37℃孵育1h。

10.吸取樣品，在2%的凝膠孔內加樣；並在第一孔內加入分子量標記物。

11.將凝膠置於0.5倍TBE緩衝液的電泳槽內，按4V/cm電壓電泳7h。

12.將電泳後的凝膠置於0.5μg/ml的EB水溶液中染色30min。

13.用雙蒸水洗滌凝膠1~2h，其間換水數次。

結果觀察

將凝膠置UV透射儀上觀察：典型的凋亡能看到200bp及其倍體的DNA梯帶。

1陰性對照

2細胞色素誘導16小時

3細胞色素誘導36小時(凋亡)

4細胞色素誘導72小時(凋亡)

凝膠電泳特點

(1) 本方法不能檢測單個細胞水平的凋亡。

(2) 不能提供細胞發生凋亡所處的組織位置和細胞分化狀態。

螢光染料染色-流式細胞測定凋亡細胞

* 細胞凋亡在細胞學上發生一系列特徵性變化，如細胞周期停滯、細胞膜表面蛋白質分子表達的水平及類型發生改變、細胞膜皺縮引起光散射性質發生相應的變化等。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著下降，但是對90°角光散射的能力增加或沒有變化。前向角散射的上升或下降與細胞的大小有關，90 °角散射的改變與細胞內結構，特別是染色質的濃縮有關。

* 在細胞凋亡晚期，前向角和右向角光散射的能力均降低。因此，通過流式細胞儀檢測細胞光散射的改變可以獲得凋亡細胞的一些信息。但是，細胞的機械損傷、分離獲得的細胞核、以及壞死細胞的前向角光散射能力也均表現下降。另外，晚期凋亡細胞，細胞膜表面蛋白可能丟失，凋亡細胞表型複雜化也使光散射能力的分析出現複雜的結果，因此單純前向角光散射降低不是凋亡細胞特有的標誌。

* 根據碘化丙啶(PI)只能使壞死細胞著色，而雙苯並咪唑(Ho)卻可穿越細胞膜對活細胞和凋亡細胞的DNA進行染色，在紫外光激發下產生不同顏色螢光的特點，因此採用單一PI或者Ho染色法，或者應用兩種染料通過復染並結合流式細胞儀的精確分析，可達到對凋亡細胞、壞死細胞和活細胞進行鑑別與定量的目的。

電子顯微鏡觀察法

透射電子顯微鏡已經用於凋亡細胞的檢測。鏡下可見凋亡細胞體積變小、細胞質濃縮、細胞核變小、染色質濃縮並凝結成塊，出現染色質沿核膜內側排列的核邊集現象。晚期的凋亡細胞，清晰可見細胞核裂解產生的凋亡小體。

PS(磷脂醯絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

凋亡早期，細胞內膜的磷脂醯絲氨酸(PS)移位到細胞外膜，而螢光標記或生物素偶聯的annexin V(磷脂結合蛋白)極易檢測處於外膜的PS，由於PS外膜化比凋亡引起的核酸變化更早，所以該試劑盒比DNA檢測法能更早期檢測細胞凋亡。

mRNA水平的檢測

一些基因在細胞凋亡時表達異常，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。 作為凋亡前期（ Bax ）或抗凋亡（ Bcl-2和bcl-X ）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。因此，通過定量PCR（Quantative PCR）檢測這些凋亡相關基因RNA水平的表達，也可以對凋亡進行評價

凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

該分子表達廣泛，在原核和真核生物不同種屬間具有很高的同源性。該分子具有促進某些腫瘤細胞(HL60、MGC-803、MCF-7等)凋亡的效應，可作為早期凋亡的信號評價指標。

活細胞Bid(蛋白)轉位檢測

Bcl2家族蛋白Bid通常情況下位於細胞漿內，但在凋亡發生時，Bid迅速轉入線粒體內，並引發了細胞色素C的釋放，因此，通過Bid蛋白的檢測可以監視凋亡前期的生化反應。

細胞凋亡相關抗體

* Fas(CD95)Monoclonal Antibody

* Granzyme B Monoclonal Antibody

* Fas Monoclonal Antibody

* Apoptosis Sample

* Bak Antibody

* Bcl-xL Antibody

* Caspase-10 Antibody

* Cleaved Caspase-3

* Cleaved DFF45(D224)Antibody

* Cleaved PARP(D214)Antibody

* DFF45/DFF35 Antibody

* Phospho-Bcl-2(Ser70)Antibody

細胞凋亡的醫學意義

凋亡在發生學中的作用

①在胚胎發育、器官形成過程中，必然伴隨著某些特定細胞群的凋亡，這些細胞群的凋亡是受基因控制的，可準時發生，呈現生理性細胞死亡或進行性細胞凋亡。

②淋巴系統的陰性選擇(negative selection)，指在T淋巴細胞、B淋巴細胞分化成熟時，機體經過嚴格的選擇機制，使那些編排細胞表面受體基因發生錯誤的細胞，以及有可能導致自身免疫性疾病的細胞(具有自身抗原的細胞)發生凋亡，使得淋巴細胞在成熟過程中，有95%的細胞以凋亡的方式被清除，僅有5%左右的淋巴細胞從中樞免疫器官中被分化成熟。

③神經元發育過程中也存在陰性選擇機制，以清除那些有害的(即發生錯誤連接的)或無用的神經元，因此，有50%的神經元細胞在發育成熟前以凋亡的方式被清除。

凋亡與疾病

現已發現凋亡機制的異常，即凋亡的增加或被抑制與一系列疾病的發生有關。

凋亡減少(抑制)所引起的疾病

①惡性腫瘤：有濾泡性淋巴瘤、P53突變性腫瘤、激素依賴性腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌)。

②自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、自身免疫性腎小球腎炎。

③病毒感染性疾病如對疱疹病毒、麻疹病毒、腺病毒易感性引起的疾病。

凋亡增多引起的疾病

①神經元變性，如帕金森病、側索硬化、色素性視網膜炎、小腦變性。

② 骨髓發育不良症候群，如再生性障礙性貧血。

③ 缺血性損傷，如心肌梗死、卒中、再灌注性損傷。

④ 中毒性肝炎，如酒精性肝病。

凋亡除與某些疾病發生有關，而且對許多疾病的治療有著極大的現實意義。腫瘤患者可通過基因治療啟動細胞凋亡機制，也可通過藥物(化療)來誘導和加速腫瘤細胞凋亡，以控制腫瘤的發展，並使其緩解。如在外科手術及器官移植中的再灌注性損傷，可採取啟動抗凋亡基因或應用抗凋亡藥物，來促進癒合和恢復功能。