細胞生物學/基因轉錄和轉錄後加工

細胞內遺傳信息的傳遞及調控 - 基因及其結構 - 基因轉錄和轉錄後加工 - 蛋白質的生物合成 - 基因表達的調控 - 基因的信息傳遞與醫學

基因轉錄的一般特點

基因轉錄是遺傳信息從DNA流向RNA的過程，即將DNA分子上的核苷酸序列轉變為RNA分子上核苷酸序列的過程。
DNA鏈是基因轉錄的模板。在雙鏈DNA中，作為轉錄模板的鏈稱為模板鏈(template strand)或反義鏈(antisense strand), 即與mRNA互補的DNA鏈；與模板鏈互補的另一條鏈稱為編碼鏈(coding strand)或有意義鏈(sense strand), 該鏈與轉錄產物的序列相同，只是在轉錄中將DNA中的T變為RNA中的U。模板鏈並非總在同一單鏈上，在DNA雙鏈的某一區段，以其中一條單鏈為模板，而在另一區段，以其相對應的互補鏈為模板。這種DNA鏈的選擇性轉錄也稱為不對稱轉錄(asymmetric transcription)。
轉錄的本質是一個以DNA雙螺旋鏈中反義鏈為模板，以四種核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP為原料，在RNA聚合酶作用下，遵循鹼基互補配對原則合成RNA的過程。RNA合成的方向是5'→3'生成的RNA鏈與模板鏈反向平行，游離的NTP只能連接到RNA鏈的3'-0H端。在RNA合成中不需要引子。在真核細胞中，轉錄生成的RNA是初級轉錄產物，必須經過不同方式的加工和修飾才具有生物活性。

原核細胞的基因轉錄

RNA聚合酶和ρ因子是原核細胞基因轉錄的主要因子

1. RNA聚合酶 原核細胞中只有一種RNA聚合酶，催化轉錄形成各種RNA分子。大腸桿菌的RNA聚合酶是由4種不同亞基構成的複合體，記為α₂ββ'σ，稱為全酶，沒有G亞基的複合體稱為核心酶。G亞基的主要功能是識別原核細胞基因上游的啟動子，啟動基因轉錄。核心酶的作用是催化RNA的聚合。其中β'亞基能與DNA模板結合，β亞基能與核苷三磷酸結合，並在磷酸二酯鍵形成中起作用。
2. ρ因子 ρ因子是一種蛋白質。當轉錄進行到基因末端時，p因子能識別終止信號並與之結合，使RNA聚合酶不能繼續作用而使轉錄終止。

原核細胞基因轉錄的基本過程通常被分為三個階段

1. 轉錄起始階段 首先RNA聚合酶的σ亞基識別基因上游的啟動子，使全酶與啟動子結合併形成複合體，這是轉錄起始的關鍵，隨後DNA雙鏈從局部被打開，以反義鏈為模板，按照鹼基互補配對原則將第一個核苷三磷酸結合到模板的轉錄起始點上，並與第二個核苷三磷酸形成第一個磷酸二酯鍵。通常，當RNA鏈達8～9個核苷酸後，G亞基便從全酶解離出來，至此完成轉錄的起始。
2. 轉錄的延長階段 核心酶沿模板鏈3'→5'方向移動，在滑行中使DNA雙鏈不斷解旋，並按模板的鹼基序列配對加入相應的核苷三磷酸(ATP、GTP、CTP、UTP),與DNA分子中雙鏈間鹼基配對有所不同的是轉錄中由新加入的U與模板中的A 配對，使RNA鏈以5'→3'方向不斷延長。隨著RNA鏈的延長，核心酶前面的DNA鏈不斷解旋，而核心酶後面已完成轉錄的區段則重新形成雙螺旋。
3. 轉錄的終止階段 模板DNA上具有特殊的轉錄終止序列，即終止位點，當RNA聚合酶移動至終止部位時，轉錄終止，RNA從DNA模板上脫離。原核細胞中轉錄終止有兩種形式，一種是ρ因子依賴性終止，即ρ因子在轉錄終止點與RNA聚合酶結合，使RNA鏈脫離。另一種是ρ因子非依賴性終止，由新合成RNA鏈形成局部髮夾結構(hairpin structure), 髮夾結構形成可能改變了RNA聚合酶的構象，導致了酶模板結合方式的改變，RNA聚合酶則不再向下移動，磷酸二酯鍵停止形成，RNA從模板脫離。
   

原核細胞轉錄形成的mRNA分子一般不需要加工，在合成後即可作為模板參與蛋白質的合成。而tRNA和rRNA則需要在合成初級轉錄產物的基礎上，進一步剪切修飾才能成為具有生物功能的成熟分子。例如，rRNA 基因的初級轉錄產物在核酸酶的作用下，剪切成3種rRNA，即5S rRNA, 16S rRNA ,23S rRNA, 三者比例為1:1:1。

真核細胞的基因轉錄和轉錄後加工

真核細胞基因轉錄要比原核細胞複雜得多。真核細胞基因轉錄形成初級轉錄產物的基本過程與原核細胞相似，也分為轉錄的起始、延長和終止。但所需酶及各種蛋白因子有所不同，最為複雜的是真核細胞中轉錄形成的RNA前體分子通常需要經過複雜的加工修飾過程才能成為成熟的功能形式。
與原核細胞只有一種RNA聚合酶負責全部的mRNA、rRNA、tRNA 合成不同的是，真核細胞中含有多種RNA聚合酶, 它們專一性地轉錄不同基因而生成各不相同的產物。下面介紹各種RNA的合成和加工。

真核細胞mRNA成熟前經歷首尾加工和中間剪接

1、mRNA的初級轉錄本是hnRNA mRNA是RNA中唯一具有編碼蛋白質功能的RNA分子，其前體是編碼基因在RNA聚合酶Ⅱ催化下轉錄形成的。由於mRNA前體分子的大小各不相同，被稱為不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA), hnRNA 需經過剪切修飾才能成為成熟的mRNA。
RNA聚合酶Ⅱ啟動轉錄時，需要一些稱為轉錄因子(transcription factor, TF)的蛋白質參與，才能形成具有活性的轉錄複合物。這些參與構成RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始複合物的轉錄因子通常稱為通用轉錄因子(general transcription factor), 為RNA聚合酶Ⅱ啟動轉錄所必需。通用轉錄因子有TF Ⅱ A、TF Ⅱ B 、TF Ⅱ D、TF Ⅱ E、TF Ⅱ F、TF Ⅱ H,它們在真核生物進化中高度保守。
在基因轉錄起始的過程中，RNA聚合酶Ⅱ的定位因子是TF Ⅱ D。TF Ⅱ D 由TATA-結合蛋白、(TATA-binding protein, TBP)和11種TBP關聯因子(TEP-associated factor)組成。先由TBP結合到啟動子的TATA盒，然後TF Ⅱ B 與TBP結合，TF Ⅱ B也能與DNA結合。TF Ⅱ A雖然不是必需的，但它能穩定已與DNA結合的TF Ⅱ B-TBP複合體，並且在TBP與不具有特徵序列的啟動子結合（這種結合較弱）時發揮重要作用。TF Ⅱ B-TBP複合體再與由RNA聚合酶Ⅱ和TF Ⅱ F組成的複合體結合。TF Ⅱ F的作用是通過和RNA聚合酶Ⅱ一起與TF Ⅱ B 相互作用，降低RNA聚合酶Ⅱ與DNA的非特異部位的結合，來協助RNA聚合酶Ⅱ靶向結合啟動子。最後是TF Ⅱ E和TF Ⅱ H加入，形成閉合複合體，完成轉錄起始複合物的裝配。TF Ⅱ H具有解旋酶活性，能使轉錄起始點附近的DNA雙螺旋解開，使閉合複合體成為開放複合體，啟動轉錄。當合成一段60～70bp的RNA後，TF Ⅱ E和TF Ⅱ H釋放，RNA聚合酶Ⅱ進入轉錄延長期。一旦RNA合成結束，轉錄即終止。有關真核生物轉錄終止的機制目前尚不清楚。
2、成熟的mRNA是hnRNA經過戴帽、加尾和剪接後形成的 轉錄形成的前體RNA需經過加工過程成為成熟的mRNA, 才能進入細胞質進行蛋白質合成。加 工過程包括戴帽、加尾和剪接。
(l)5'末端加上「帽子」結構——戴帽：戴帽(capping)是指對hnRNA 5'端進行化學修飾，即首先在mRNA前體S'端開始的第一個核苷酸上接上一個三磷酸鳥嘌呤，然後在甲基轉移酶的作用下，在鳥嘌呤第7位的氮上進行甲基化，形成一個7-甲基鳥嘌呤三磷酸(m⁷Gppp)的帽子結構，同時在原來第一個核苷酸的2'-O上也進行甲基化，因此，一個帽帶有二個甲基。新生的mRNA的長度達25～30bp時，就開始進行戴帽修飾。mRNA戴帽的作用一是能封閉mRNA 5'端，使其不再加接核苷酸，同時也防止轉運時被核酸酶水解，增強mRNA的穩定性；二是帽子結構能被核糖體小亞基識別，有利於mRNA最初翻譯的準確性。
(2) 3'末端加上「尾」結構——加尾：加尾(tailing)是指對mRNA前體3'端的修飾過程，即在腺苷酸聚合酶的作用下，在3'端加上由200～250個腺苷酸組成的多聚腺苷酸(poly-A)的尾巴。加尾一方面可使mRNA3'端穩定，防止被核酸酶水解，另一方面有利於mRNA由核到細胞質的轉運。
目前發現，決定mRNA前體分子加尾的信號序列存在於mRNA 3'端，即在發生多聚腺苷酸化位點的上游10～30bp處存在一高度保守的6核苷酸序列（在哺乳動物中為AAUAAA)，在多聚腺苷酸化位點的下游常存在富含G和U的序列。這些序列可被 含有腺苷酸聚合酶的複合物所識別，進行加尾。
(3)剪接：基因轉錄過程是以一段連續的DNA序列為模板進行的，在初級轉錄產物中包含有內含子和外顯子序列，在形成成熟mRNA過程中，需將hnRNA中的內含子切除，形成由連續編碼序列組成的mRNA模板。剪接(splicing)即是將RNA前體分子中內含子切除，將外顯子拼接的過程。對真核生物外顯子與內含子相鄰序列研究發現，初級轉錄產物中的內含子常以GU開始，以AG結束，被認為是真核生物基因特有的剪接信號，也稱剪接點。幾乎所有真核生物基因的內含子均遵循這一GU-AG規則表明這類內含子存在著共同的剪接機制。完成hnRNA剪接需要有三個必需的序列：5'GU序列，3'AG序列和分支點(branch site)。分支點位於內含子3'端上游約30個鹼基處，為一高度保守的A, 在3剪接位點的識別中起重要作用。點突變研究表明，剪接點GU或AG的突變可以阻止剪接的出現。例如，人類的β-珠蛋白生成障礙性貧血可能就是由於β-珠蛋白的hnRNA的內含子剪切點順序發生改變，不能形成成熟的B珠蛋白mRNA, 因而不能合成正常的血紅蛋白，從而導致疾病。
mRNA前體的剪接是通過剪接體(spliceosome)完成的。剪接體大小為60S, 由數種小分子核糖核蛋白顆粒(small nuclear ribonucleoprotein particle, snRNP)組成。snRNP由細胞核中存在的一類小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)和一些蛋白質組成，常見的snRNA有U1、U2、U4、U5和U6，除U6snRNA由RNA聚合酶Ⅲ轉錄外，其他snRNA均由RNA聚合酶Ⅱ催化合成。首先U1 snRNP結合到具有5'帽結構的hnRNA內含子5'剪接點，隨後U2 snRNP結合到內含子分支點，這一過程需要ATP供能。接著，U4、U5、U6 snRNP以複合體的形式與先期已經結合於mRNA前體分子的Ul、U2裝配成無活性的剪接體；再通過內部的重排，U1、U4被排出剪接體，從而使無活性的剪接體轉變為有活性的剪接體。此後，發生兩步反應，第一步， 分支點上的核苷酸A接近5'剪接點，內含子與5'外顯子被從此處斷開，切斷的內含子5'端與核苷酸A共價連接形成套索狀(lariat)結構。第二步，5'外顯子上的3'-0H端與3'外顯子的起始部位結合，並切割3'剪接點，3'和5'端外顯子彼此連接，剪接體各組分和套索狀結構脫離，剪接完成。

核仁DNA編碼的rRNA分子都來源於一個前體分子的合成後加工

真核細胞中的rRNA基因串聯排列於特定的核仁染色質區段，為多拷貝基因，人體每個單倍體基因組上包含有200個rRNA基因拷貝，每個基因之間由不轉錄的間隔DNA分隔，這種間隔長度在不同種屬生物間差別較大。每個基因由3個外顯子和2個內含子組成，3個外顯子依次為編碼18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA的前體序列，共同組成一個轉錄單位。在RNA聚合酶Ⅰ催化下轉錄形成原始rRNA前體——45SrRNA, 最終剪切為28S、18S和5.8S rRNA。
rRNA前體的另一種加工形式是甲基化，主要發生在核糖的2'-羥基，一般認為，這種化學修飾有利於前體rRNA的有效裂解。
有研究表明，rRNA的剪接不需要任何蛋白質的參與即可發生，進行的是自身剪接。1982年T.Cech等發現在四膜蟲細胞的rRNA剪接過程中，前體rRNA釋放出一種能催化寡核苷酸底物剪接的短鏈RNA(Ll9RNA), 即為一種具有酶活性的核酶(ribozyme)。

新合成的tRNA只有經過加工修飾後才能成為有活性的分子

tRNA是一類小分子量的RNA分子，真核細胞中有50～60種。它們能夠識別mRNA中的密碼子並攜帶由密碼子所指定的胺基酸進行蛋白質的合成。在真核細胞中含有多個編碼tRNA的基因，人體細胞中有1300個拷貝，成簇存在並被間隔區分開，在RNA聚合酶Ⅲ的作用下被轉錄為tRNA前體。tRNA前體基因轉錄需要兩種轉錄因子，TFⅢB和TFⅢC ,它們可與tRNA基因轉錄起始點下游+10～+60中的兩個特殊區段結合形成複合物，該複合物與RNA聚合酶Ⅲ結合，啟動tRNA基因的轉錄。
真核生物tRNA前體約為100個核苷酸長度，這種新轉錄生成的tRNA前體一般無生物活性，需要進行剪接和鹼基修飾才能形成成熟的tRNA。
(1)tRNA前體的剪接：由真核細胞RNA聚合酶Ⅲ催化產生的tRNA前體，在RNA酶作用下，tRNA前體的5'末端和相當於反密碼環的區域分別被切除一定長度的多核苷酸鏈，再由連接酶催化而拼接形成成熟的tRNA。
(2)tRNA前體的化學修飾：成熟的tRNA分子中有許多的稀有鹼基(rare base)，這些稀有鹼基常通過化學修飾而成，這些化學反應包括：①甲基化反應，tRNA在甲基轉移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤；②還原反應，尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶；③核苷內的轉位反應，尿嘧啶核苷轉變為假尿嘧啶核苷；④脫氨基反應，部分腺甘酸脫氨基成為次黃嘌呤核苷酸。
(3) 3'末端加上CCA：在核苷酸轉移酶的作用下，3'末端除去個別鹼基後，換上tRNA分子統一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的胺基酸臂結構。
原核生物tRNA成熟的機制與真核生物相同。

5S rRNA由核仁外基因編碼

5S rRNA是一類特殊的rRNA分子。與其他類型的rRNA分子不同，5S rRNA是由核仁外的基因編碼，5S rDNA為串聯排列的多拷貝基因，在RNA聚合酶Ⅲ的作用下， 5S rDNA轉錄為5S rRNA。由於在5S rDNA中無內含子存在，所以，由5S rDNA轉錄形成的5S rRNA無需進一步的剪切加工，即可轉運至核仁中，直接參與核糖體大亞基的組裝。