生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/RNA瓊脂糖凝膠電泳

實驗目的

掌握植物總RNA非變性膠電泳的原理和方法。

實驗原理

RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動率才與分子量的對數呈線性關係。因此要測定RNA分子量時，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時，配製普通的1%瓊脂糖凝膠即可。

實驗材料、器具及藥品

蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩衝液，0.5μg/ml溴化乙錠（EB）10X載樣緩衝液。

實驗步驟

1. 用1×TAE電泳緩衝液製作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩衝液至液面覆蓋凝膠。
2. 在超淨工作檯上，用移液器吸取總RNA樣品4μl於封口膜上。在實驗台上再加入5μl 1×TAE電泳緩衝液及1μl 的10X載樣緩衝液，混勻後，小心加入點樣孔。
3. 打開電源開關，調節電壓至100V，使RNA由負極向正極電泳，約30min後將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結果。

RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測

試劑

1. MOPS緩衝液（10*）:0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。
2. 上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍，0.4%二甲苯藍。
3. 甲醛。
4. 去離子甲醯胺。v電泳槽清洗：去污劑洗乾淨（一般浸泡過夜）——水沖洗——乙醇乾燥——3%H2O2灌滿——室溫放置10分鐘——0.1%DEPC水沖洗。

操作

1. 將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍，晾乾備用。
2. 配製瓊脂糖凝膠。
   • ①稱取0.5g瓊脂糖，置乾淨的100ml 錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。
   • ②待膠涼至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩衝液和0.5ul 溴化乙錠，混合均勻。
   • ③灌制瓊脂糖凝膠。

樣品準備：

• ① 取 DEPC處理過的500ul小離心管，依次加入如下試劑： 10x MOPS緩衝液2ul，甲醛3.5ul,甲醯胺（去離子）10ul，RNA 樣品 4.5ul,混勻。
• ② 將離心管置於60℃水浴中保10分鐘，再置冰上2分鐘。
• ③ 向管中加入3ul 上樣染料，混勻。

電泳

電泳槽內加入1XMOPS緩衝液，於7.5V/ml 的電壓下電泳。

電泳結束後，在紫外燈下檢查結果。