生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/目的基因PCR擴增產物的克隆

實驗原理

PCR產物回收

在高離子鹽存在的情況下，DNA片斷選擇性的吸附於離心柱內的矽基質膜上，再通過一系列快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液，將引子、核苷酸、蛋白酶等雜質去除，最後用低鹽，高pH值的洗脫緩衝液將純淨DNA從矽基質膜上洗脫。

T載體與PCR產物的連接

源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩衝系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP複合物；然後，酶-ATP複合物再結合到具有5』磷酸基和3』羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最後產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對於單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底，可對載體進行5』除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3』OH末端與5』端，所以除磷後載體不會自環。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5』端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自身成環造成的高本底。對於雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環，能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在37℃時有利於連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此採取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前後末端都有一個游離的A鹼基，可以與T -Vector 末端游離的T鹼基互補形成環狀重組T質體。

實驗材料、試劑和儀器

PCR擴增相關試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像系統、PCR產物回收試劑盒、pUCm-T載體。

實驗步驟

PCR擴增

PCR反應體系

10×PCR Buffer	2.5 μl
dNTPs	0.5 μl
Taq	0.2 μl
引子1	1.5 μl
引子2	1.5 μl
ddH20	17.3 μl
DNA模板	1.5 μl

註：每組做5管，其中4管用於PCR產物回收，1管作電泳檢測時的對照

PCR反應程序

1	94℃預變性	5min
2	94℃變性	45s
3	60℃退火	30s
4	72℃延伸	60s
2－4步驟，35循環
5	72℃延伸	10min
6	4℃	保存

目的基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測

1. 製備瓊脂糖凝膠：稱取0.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入20ml 1.0×TBE緩衝液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。
2. 取有機玻璃內槽，洗淨，晾乾，用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好（一定封嚴，不能留縫隙）。
3. 將有機玻璃內槽放置於一水平位置，並放好樣品梳子。
4. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。
5. 待膠凝固後，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內。
6. 加入電泳緩衝液至電泳槽中。
7. 用移液槍將已加入上樣緩衝液的DNA樣品加入加樣孔中（記錄點樣順序及點樣量）。
8. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1~2cm處，停止電泳。

產物回收

1. 在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf離心管中；加入500μl溶膠/結合液DB，充分混勻。
2. 將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1 min，12000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液。
3. 加入700μl漂洗液WB，12000rpm離心1min，棄掉廢液。
4. 加入500μl漂洗液WB，12000rpm離心1 min，棄掉廢液。
5. 將吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm離心2 min，儘量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
6. 取出吸附柱AC，放入一個乾淨的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩衝液EB（洗脫緩衝液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2 min，12000rpm離心1 min。如果需要較多量DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱，離心1 min。

PCR產物與T載體的連接

對於常規的DNA ligase連接反應，請參考下面的連接反應體系，或按DNA ligase的說明書進行操作。每個連接反應使用1μl  pMD 18-T載體，約0.2pmol PCR產物，在10μl連接體系中4℃連接過夜或室溫連接1h。

T4 DNA Ligase Buffer(2X)	5μl
Purified PCR Product	1μl
pMD 18-T Vector	1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/微升)	1μl
ddH2O	up to 10μl

大腸桿菌感受態細胞的製備(氯化鈣法)

• ① 挑取新鮮的E.coli.DH5α單菌落接種於一個含有10 ml LB液體培養基（不含抗生素）的試管中，於37℃恆溫振盪（200 rpm）培養約4h(OD=0.2~0.4)，取出後立即將其冰浴10min。
• ② 在無菌條件下將冰浴後的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無菌離心管中，於4℃下10000g離心1min，回收細菌。
• ③ 每管中加入500 μl於4℃下預冷的CaCl2重懸沉澱，冰浴30min，於4℃下10000g離心1min，回收細菌沉澱物。
• ④ 每管加入200 μl冰預冷的CaCl2，混勻即為感受態細胞，置4℃冰箱備用。

重組質體轉化大腸桿菌

• ① 取10 μl連接產物，加入內裝100 μl感受態細胞的離心管中，輕彈管壁混勻，冰浴30 min。
• ② 42℃熱擊90s後，迅速將離心管冰浴3~5min。
• ③ 加入1 ml不含抗生素的LB液體培養基，混勻，於37 ℃下振盪培養（180 rpm）45 min。
• ④ 4℃下，10000 g，離心1 min，吸出500 μl上清液棄去，再混勻，取200 μl塗布於含有100 μg/ml氨苄青黴素的LB培養基平板上（事先塗布4μl濃度為200 mg/mg IPTG和20μl濃度為40 mg/ml X-gal），待菌液被培養基完全吸收後，倒置平板於37℃培養12~16h，直至出現單菌落。再將培養皿置於4℃，使其完全顯色（即出現藍、白斑）。
• ⑤ 連接產物轉化實驗的同時，以等體積的ddH2O代替連接產物，其操作同上，分別塗布於含抗生素和不含抗生素的LB平板上，分別作為陰性對照和陽性對照。

重組子克隆的鑑定（本部分視實驗進程而定）

挑取可能含有目的片段的白斑，接種到5 ml LB/Amp液體培養基中，37℃ 220 rpm搖床培養過夜。採用鹼裂解法小量提取菌液質體DNA，進行PCR擴增，檢測PCR產物是否連接到載體中。

附：TBE電泳緩衝液的配製

5×TBE（5倍體積的TBE貯存液）

配1000ml 5×TBE：

Tris	54g
硼酸	27.5g
0.5mol/l EDTA	20ml（pH 8.0）