生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/SSR分子標記實驗操作及其注意事項

SSR(Simple Sequence Repeats ) 又稱微衛星DNA，是一類由幾個(多為1~6個) 鹼基組成的基序(motif )串聯重複而成的DNA序列，其長度一般較短，它們廣泛分布於整個基因組的不同位置上，每個座位上重複單位的數目及重複單位的序列都可能不完全相同，因而造成了每個座位上的多態性。SSR標記數量豐富，覆蓋整個基因組，而且分布均勻，多態性高，呈共顯性遺傳，重複性好，操作簡便，是一種理想的分子標記技術，被廣泛應用於構建基因連鎖圖分子輔助育種品種鑑定遺傳資源的保存等方面。

試劑配製

1. 0.2%親水binding silence（現配現用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混勻後使用。
2. 0.5%疏水repel silence（購買後可直接使用）
3. TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.攪拌溶化，定容至1000ml，無需滅菌，室溫保存，母液的pH值應保持在8.3左右。
4. Urea－TBE(一塊膠板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加雙蒸水溶解後定容至51ml，使用漏斗過濾。
5. 40％丙烯醯胺：丙烯醯胺,380g;甲叉雙丙烯醯胺,20g.加熱至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纖維素濾膜（入Nalge濾器，0.45μm孔徑）過濾，棕色瓶避光保存於室溫。
6. 10％APS（過硫酸銨）：超純過硫酸銨,2g;超純水,18ml.溶解後，4℃保存。
7. TEMED（購買後可直接使用）：電泳級的TEMED可購自Bio-Rad，Sigma或其他供應商。
8. Loading buffer：去離子甲醯胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈藍cyanol,0.125g;溴酚藍,0.125g.混勻後置於4℃保存。
9. 固定液：無水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配製成終濃度為10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10. 染色溶液(ACS 試劑)：無水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配製成終濃度為10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11. 顯影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。終濃度為3％NaOH，0.1%甲醛。

DNA提取過程中的注意事項

1. 避免試驗材料間DNA的交叉污染或外來DNA的污染。使用冷凍乾燥葉片法，可以將每個樣品在單獨的離心管中研磨，研磨使用的小鋼珠球最好是一次性的，如果是反覆使用的小鋼珠球，必須徹底清洗乾淨使用液氮和研缽研磨葉片組織時，必須在每次研磨前徹底清理乾淨研缽和研磨棒。
2. 試驗材料應選取幼嫩組織，因為植物幼嫩組織DNA含量高，且多糖多酚含量少。
3. 裝入離心管的葉片組織最好不要超過離心管的1/3-1/2，否則會引起細胞裂解不完全，導致產量和純度下降。
4. 使用液氮研磨時，要先將研缽用液氮冷卻，在加入液氮後，要先將葉片壓碎，研磨時要快速用力，儘量使樣品磨成粉末狀。
5. 水浴前需要確保試管蓋蓋嚴，或使用輔助工具進行加固，以防止水浴時因溫度較高導致試管蓋開裂。
6. 水浴過程中，每隔10-15min將離心管取出振盪搖勻，使粉碎的葉片組織儘量與裂解液充分接觸，破壞細胞結構，釋放DNA。
7. 實驗過程中振盪動作不宜劇烈，移液槍頭最好使用大孔槍頭，移液動作不能太快，以免使DNA斷裂。
8. 當DNA以小球狀固體沉積在離心管底部後，傾倒離心管中多餘液體時，應避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液體後，改用吸水紙吸取剩餘液體。
9. DNA風乾最好在無菌操作台上進行，待乙醇徹底風乾後才能加入TE或ddH2O溶解，如果有殘留的乙醇，可能會影響PCR反應的試驗結果。
10. 如果DNA純度不好，可將粗提物用溶液1×TE充分溶解，離心後，取上清液再次沉澱DNA，可有效除去多糖。

實驗步驟

玻璃板清洗：

1. 用洗滌劑把玻璃反覆擦洗乾淨，用酒精擦乾、乾燥。在疏水玻璃板上均勻塗上300-500μL的0.5%的疏水劑Binding Silane。可放置過夜。
2. 配製凝膠前，在親水玻璃板上均勻塗上2％的親水劑Repel Silane，保證玻璃板的每個地方都塗上親水劑，晾乾至少5min，然後用酒精輕輕擦拭以去掉多餘的親水劑。
3. 玻璃板徹底乾燥後進行玻璃板組裝。兩塊玻璃板兩邊邊緣割傷配套的硬紙條，橡皮夾子夾住兩邊，在橡皮夾子裡加上硬紙片可以保證玻璃板的水平，可以有效地防止條帶跑歪。下邊套上有旋鈕的塑料套，旋緊旋鈕，以防止底下漏膠在插入梳子的位置插入一個硬紙條以保證上方凝膠界面水平且整齊。
4. 將裝好的玻璃板水平放置於桌面上，親水玻璃板至於下面，而帶電極的疏水玻璃板朝上，保證玻璃板的水平。

聚丙烯醯胺凝膠的製備

每一塊膠的用量配製如下：（大膠）

Urea-TBE	51ml
40%丙烯醯胺	9ml
10%APS	400μl
TEMED	30μl
共計	約60ml

• 迅速輕輕搖勻，注意不要用力攪拌，混勻後立即灌膠。
• 將混合液導入大注射器中，將導管中氣泡擠出，迅速將導管口插入灌膠口，在重力作用下，混合液流入兩塊玻璃板之間，人為控制流速以防止氣泡產生。
• 灌膠完成後，聚合時間至少在1小時，若凝膠要放置過夜，則須在凝膠兩頭鋪上濕濾紙（以1×TBE浸濕）以防止凝膠變干。4℃保存，凝膠使用之前可保存1-2天。

凝膠電泳

1. 正極槽（底下）中加入600ml的1×TBE緩衝液，組裝上配好凝膠的玻璃板，拔去維持凝膠上方水平的硬紙條，負極槽上加入800ml的0.5×TBE緩衝液直至覆蓋了凝膠上方。
2. 將凝膠上方多餘的膠用槍沖洗乾淨，並將氣泡清除。
3. 預電泳30min，保持在恆定功率55W（相當於電壓1441V，電流38mA）。
4. 預電泳完成後，關閉電源，用槍將凝膠上方多餘的氣泡和膠清除乾淨，插入梳子，再用槍將梳子中的氣泡清除乾淨。
5. 加入3μl已由loading buffer處理過的樣品DNA，每塊板子可點1-3個Marker，55W恆定功率電泳1.5h，至第一條Loading buffer指示帶（二甲苯青帶，約相當於260bp雙鏈DNA）跑至膠板的2/3處（距底部1/3處）時停止電泳。
6. 通過帶電極玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE緩衝液，剩餘的0.5×TBE緩衝液直接倒掉，緩衝液可反覆使用幾次。
7. 小心的分開兩塊玻璃板，這時凝膠會粘連在塗有親水劑的玻璃板上。

銀染

1. 將帶凝膠的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝膠朝下放置，玻璃板位於上方。
2. 將玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3  (ACS 試劑)）中15min，凝膠朝下放置，玻璃板位於上方。
3. 用自來水（最好用雙蒸水）短時間（5-10s）沖洗玻璃板兩面，玻璃板須離水近些，否則凝膠容易變黑。
4. 將凝膠浸在顯影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，顯影20-30min，直至帶紋出現。凝膠朝上放置。
5. 用自來水（最好用雙蒸水）沖洗凝膠兩遍，每次2min。
6. 室溫下自然乾燥，乾燥後的膠板覆蓋保鮮膜，可以永久保存，也可以進行拍照記錄。

PCR反應

模板及引子配製

• 模板DNA：使用25ng/μl的DNA作為模板。
• 引子：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引子。

DNA片段擴增

取2uL烯釋的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反應液：

H2O	13.5
10×buffer	2
dNTPs(10mM)	0.4
引子Ⅰ(25uM)	0.4
引子Ⅱ(25uM)	0.4
MgCL2(1.5mM)	1.2
Taq酶(5U/uL)	0.1
Total	18

混合後按如下PCR程序擴增：

Step1	95℃	9M；
Step2	94℃	50S；
Step3	退火溫度	45S；
Step4	72℃	90S；
Srep5	Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step6	72℃	7M

擴增後的樣品中加入3/4體積的Loading Buffer，混合，95℃變性，待用。

PCR 反應實驗操作注意事項

PCR 反應過程中應特別注意不要使樣品相互污染， 以免造成試驗結果不准確， 同時也要注意所加試劑或樣品必須是經過混勻後的液體， 這樣才能保證反應液各成分的濃度和體積的均一性 所用試劑需從正規商家購進， 以保證試劑的質量。

1. 儘量使用一次性手套 專用整套移液器 成套試劑和其他必需品， 避免外來 DNA 污染反應體系
2. DNA 模板應稀釋為適宜的濃度， 使加入 PCR反應的 DNA 樣品體積最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板樣品量太少， 僅有1 ～ 2 l， 不僅實驗操作難度大， 而且如果操作時間長， 會導致 DNA 反應液部分或全部蒸發掉， 影響 PCR 反應結果。
3. 可以先將 DNA 樣品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反應混合液 加樣時選擇不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反應混合液， 這樣槍頭靠壁加樣時不會交叉污染。
4. 加樣完畢後， 蓋上蓋子， 混勻反應液， 再低速離心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即進行 PCR 擴增， 需將 PCR 反應混合液置於 － 20 ℃保存備用。
5. PCR 擴增反應使用的酶不能長時間放置於室溫下， 須隨用隨取， 使用完畢後立即放回 － 20 ℃冰箱否則， 酶易失活。
6. PCR 反應的退火溫度應根據不同的引子來確定最佳退火溫度， 以確保擴增的條帶中雜帶少， 目標帶明顯， 引子退火溫度一般按照 T_m = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式計算。