生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/變性梯度凝膠電泳

實驗原理

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決於DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當於此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴於DNA序列，即使一個鹼基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單鹼基的替代、移碼突變以及少於10個鹼基的缺失突變。

為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區——GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側引子的5′端加上一個30~40bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處於低熔點區而便於分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近於100%。

作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優點：

1. 突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。
2. 檢測片段長度可達1kb，尤其適用於100~500bp的片段。
3. 非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。
4. 操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。
5. 重複性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引子也比較昂貴。

實驗方法

• 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

實驗材料

• DNA樣品

試劑、試劑盒

• 尿素
• 去離子甲醯胺
• 丙烯醯胺
• 甲叉雙丙烯醯胺
• 瓊脂糖

儀器、耗材

• PCR擴增儀
• 變性梯度凝膠電泳儀
• 凝膠成像及分析系統
• 紫外透射儀
• 高速離心機
• 電泳儀
• 電泳槽
• 微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）
• Tip頭
• Tip頭盒（200μl，20μl）
• Eppendorf管（0.5ml，0.2ml）
• Eppendorf管架
• PCR擴增相關試劑

實驗步驟

1. PCR反應（同前）：其中，上游引子加40bp [GC] Clamp。
2. PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。
3. 垂直變性梯度凝膠電泳：變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯醯胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲醯胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲醯胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引子的最適解鏈條件（即變性濃度）。PCR產物加上樣緩衝液後上樣，300～400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間2～4小時。
4. 平行變性梯度凝膠電泳：變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，製備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。PCR產物加上樣緩衝液後，25μl～30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間3～6小時。
5. 染色5分鐘，凝膠成像儀分析結果。

注意事項

1. 該實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴格操作，做好防護保護自己。
2. 嚴格按操作步驟。