生物化學與分子生物學/酶促反應動力學

酶與酶促反應- 酶的分子結構與功能 - 酶的工作原理 - 酶促反應動力學 - 酶的調節 - 酶的分類與命名 - 酶在醫學中的應用
酶促反應動力學(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反應速率以及各種因素對酶促反應速率影響機制的科學。酶促反應速率可受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑及激活劑等。研究酶促反應動力學具有重要的理論和實踐意義。

底物濃度對酶促反應速率的影響呈矩形雙曲線

底物濃度對酶促反應速率的影響

在酶濃度和其他反應條件不變的情況下，反應速率(v)對底物濃度[S]作圖呈矩形雙曲線。當[S]很低時，v隨[S]的增加而升高，呈一級反應；隨著[S]的不斷增加，v上升的幅度不斷變緩，呈現出一級反應與零級反應的混合級反應；再隨著[S]的不斷增加，以至於所有酶的活性中心均被底物所飽和，v便不再增加，此時v達最大反應速率(maximum velocity, V_max) , 此時的反應可視為零級反應。

米-曼方程揭示單底物反應的動力學特性

1902年，Victor Henri提出了酶-底物中間複合物學說，認為首先是酶(E)與底物(S)生成酶底物中間複合物(ES),然後ES分解生成產物(P)和游離的酶。
${\ce {E + S <=>[k_1][k_2] ES ->[k_3] E +P}}$（式1）

式中k₁、k₂和k₃分別為各向反應的速率常數。

1913年， Michaelis L 和 Menten M 根據酶－[S]的矩形雙曲線加以數學處理，得出單底物v與[S]的數學關係式，即著名的米-曼方程，簡稱米氏方程(Michaelis equation) 。

$v={\tfrac {V_{max}[S]}{K_{m}+[S]}}$(式2)

式2中K_m為米氏常數(Michaelis constant), V_max為最大反應速率。當[S]遠遠小於K_m時，式2分母中的[S]可以忽略不計，米氏方程可以簡化為$v={\tfrac {V_{max}}{K_{m}}}[S]$， 此時v與[S]成正比關係，反應呈一級反應。當[S]遠遠大於K_m時，方程中的K_m可以忽略不計，此時 v=V_max，反應呈零級反應。

米氏方程的推導基於這樣的假設（或前提）：

• 反應是單底物反應；
• 測定的反應速率為初速率（即指反應剛剛開始，各種影響因素尚未發揮作用時的酶促反應速率）；
• 當[S]遠遠大於[E]時，在初速率範圍內，底物的消耗很少(<5%)，可以忽略不計。

米氏方程的推導如下：

根據式1,ES的生成速率＝k₁([E_t] -[ES]) [S] , ES的分解速率=k₂[ES]+k₃[ES]。 式中[E_t]表示酶的總濃度，[E_t]-[ES]表示游離酶的濃度[E]。

當反應系統處於穩態時，ES的生成速率=ES的分解速率，即：

k₁([E_t] -[ES]) [S] = k₂ [ES] +k₃[ES](式3)

對式3整理得：

${\tfrac {([E_{t}]-[ES])[S]}{[ES]}}={\tfrac {k_{2}+k_{3}}{k_{1}}}$(式4)

令$K_{m}={\tfrac {k_{2}+k_{3}}{k_{1}}}$（式5）

將式5代入式4並整理得：

$[ES]={\tfrac {[E_{t}][S]}{k_{m}+[S]}}$（式6）

由於在初速率範圍內，反應體系中剩餘的底物濃度(>95%)遠超過生成的產物濃度。 因此，逆反應可不予考慮，整個反應的速率與 ES的濃度成正比，即：

v=k₃[ES](式7)

將式6代入式7得：

$v={\tfrac {k_{3}[E_{t}][S]}{k_{m}+[S]}}$(式8)

當所有得酶均形成ES時（即[ES]=[E_t]），反應速率達到最大，即

V_max=k₃[E_t](式9)

將式9代入式8即得米氏方程：

$v={\tfrac {V_{max}[S]}{K_{m}+[S]}}$

K_m與V_max是重要的酶促反應動力學參數

• K_m值等於酶促反應速率為最大反應速率一半時的底物濃度

當v等於V_max的一半時，米氏方程可變換為：

${\tfrac {V_{max}}{2}}={\tfrac {V_{max}[S]}{K_{m}+[S]}}$

經整理得K_m=[S]。

• K_m值是酶的特徵性常數

K_m值的大小並非固定不變，它與酶的結構、底物結構、反應環境的pH、溫度和離子強度有關，而與酶濃度無關。各種酶的K_m值是不同的，酶的K_m值多在 10^-6 ~10^-2mol/L 的範圍。

• K_m在一定條件下可表示酶對底物的親和力

米氏常數(K_m)是單底物反應中 3 個速率常數的綜合，即$K_{m}={\tfrac {k_{2}+k_{3}}{k_{1}}}$。已知，k₃為限速步驟的速率常數。 當k₃遠遠小於k₂時，K_m≈k₂/k₁，即相當於ES 分解為E+S 的解離常數(dissociation constant, K_s)。 此時，K_m代表酶對底物的親和力。K_m越大，表示酶對底物的親和力越小；K_m越小，酶對底物的親和力越大。但並非所有的酶促反應都是k₃遠遠小於k₂ ，有時甚至k₃遠遠大於k₂ ，這時的K_m就不能表示酶對底物的親和力。

• V_max是酶被底物完全飽和時的反應速率

當所有的酶均與底物形成 ES 時（即 [ES] = [E_t]) ，反應速率達到最大，即 V_max =k₃[E_t]。

• 酶的轉換數

當酶被底物完全飽和時(V_max ),單位時間內每個酶分子（或活性中心）催化底物轉變成產物的分子數稱為酶的轉換數(turnover number) , 即 k₃為酶的轉換數，單位是 s^-1酶的轉換數可用來表示酶的催化效率。如果酶的總濃度([E_t]) 已知，便可從 V_max 計算酶的轉換數。 例如， 10^-6mol/L 的碳酸酐酶溶液在一秒鐘內催化生成 0. 6mol/L H₂CO₃ , 則酶的轉換數 k₃為：

$k_{3}={\tfrac {V_{max}}{[E_{t}]}}={\tfrac {0.6mol/(L\cdot s)}{10^{-6}mol/L}}=6\times 10^{5}/s$

對於生理性底物來說，大多數酶的轉換數在 1~10⁴/s 之間。

K_m和V_max常通過林-貝作圖法求取

雙倒數作圖法

酶促反應的 v 對[S] 作圖為矩形雙曲線，從此曲線上很難準確地求得反應的K_m和 V_max。 於是，人們對米氏方程進行種種變換，採用直線作圖法準確求得K_m和 V_max，其中以林－貝 (Lineweaver-Burk) 作圖法最為常用。

林－貝作圖法又稱雙倒數作圖法。 即將米氏方程的兩邊同時取倒數，並加以整理得一線性方程，即林－貝方程：

${\tfrac {1}{v}}={\tfrac {K_{m}}{V_{max}}}\cdot {\tfrac {1}{[S]}}+{\tfrac {1}{V_{max}}}$

以1/v對1/[S]作圖，縱軸上的截距為1/V_max，橫軸上的截距為-1/K_m。

底物足夠時酶濃度對酶促反應速率的影響呈直線關係

當[S] 遠遠大於[E]時，反應中[S] 濃度的變化量可以忽略不計。此時，隨著酶濃度的增加，酶促反應速率增大，兩者呈現正比關係。

溫度對酶促反應速率的影響具有雙重性

酶促反應時，隨著反應體系溫度的升高，底物分子的熱運動加快，增加分子碰撞的機會，提高酶促反應速率；但當溫度升高達到一定臨界值時，溫度的升高可使酶變性，使酶促反應速率下降。大多數酶在60℃時開始變性，80℃時多數酶的變性已不可逆。酶促反應速率達最大時的反應系統的溫度稱 為酶的最適溫度(optimum temperature)。反應系統的溫低於最適溫度時，溫度每升高10℃反應速率可增加1.7～2.5倍。當反應溫度高於最適溫度時，反應速率則因酶變性失活而降低。
酶的最適溫度不是酶的特徵性常數，它與反應時間有關。酶在低溫下活性降低，隨著溫度的回升酶活性逐漸恢復。醫學上用低溫保存酶和菌種等生物製品就是利用了酶的這一特性。臨床上採用低溫麻醉時，機體組織細胞中的酶在低溫下活性降低，物質代謝速率減慢，組織細胞耗氧量減少，對缺氧的耐受性升高，對機體具有保護作用。
哺乳類動物組織中酶的最適溫度多在35～40℃之間。能在較高溫度生存的生物，細胞內酶的最適反應溫度亦較高。1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離得到一種能在70～75℃環境中生長的棲熱水生菌(Thermusaquaticus），從該菌的YTl株中提取到的Taq DNA聚合酶，其最適溫度為72℃，95℃時該酶的半壽期長達40分鐘。此酶作為工具酶已被應用於DNA的體外擴增。

pH通過改變酶分子及底物分子的解離狀態影響酶促反應速率

酶分子中的許多極性基團，在不同的pH條件下解離狀態不同，酶活性中心的某些必需基團往往僅在某一解離狀態時才最容易同底物結合或具有最大的催化活性。許多具有可解離基團的底物和輔酶的荷電狀態也受pH改變的影響，從而影響酶對它們的親和力。此外，pH還可影響酶活性中心的空間構象，從而影響酶的活性。因此，pH的改變對酶的催化作用影響很大。酶催化活性最高時反應體系的pH稱為酶促反應的最適pH(optimum pH)。
雖然不同酶的最適pH各不相同，但除少數（如胃蛋白酶的最適pH約為1.8,肝精氨酸酶的最適pH為9.8)外，動物體內多數酶的最適pH接近中性。
酶的最適pH也不是酶的特徵性常數，它受底物濃度、緩衝液種類與濃度以及酶的純度等因素的影響。溶液 pH 高於或低於最適 pH 時，酶活性降低，遠離最適 pH 時還會導致酶變性失活。在測定酶活性時，應選用適宜的緩衝液以保持酶活性的相對恆定。

抑制劑可降低酶促反應速率

凡能使酶活性下降而又不引起酶蛋白變性的物質統稱為酶的抑制劑(inhibitor) 。抑制劑可與酶活性中心或活性中心之外的調節位點結合，從而抑制酶的活性。根據抑制劑和酶結合的緊密程度不同，酶的抑制作用分為不可逆性抑制與可逆性抑制兩類。去除可逆性抑制劑，可使酶活性得以恢復。

不可逆性抑制劑與酶共價結合

不可逆性抑制劑和酶活性中心的必需基團共價結合，使酶失活。此類抑制劑不能用透析、超濾等方法予以去除。例如，有機磷農藥（敵百蟲、敵敵畏、樂果和馬拉硫磷等）特異地與膽鹼酯酶(choline esterase) 活性中心絲氨酸殘基的羥基結合，使膽鹼酯酶失活，導致乙醯膽鹼堆積，引起膽鹼能神經興奮，病人可出現噁心、嘔吐、多汗、肌肉震顫、瞳孔縮小、驚厥等一系列症狀。
解救有機磷農藥中毒時，可給予乙醯膽鹼拮抗劑阿托品和膽鹼酯酶復活劑解磷定。
低濃度的重金屬離子(Hg²⁺，Ag⁺，Pb²⁺等）及As³⁺等可與巰基酶分子中的巰基結合使酶失活。例如，路易士氣（一種化學毒氣）能不可逆地抑制體內巰基酶的活性，從而引起神經系統、皮膚、黏膜、毛細血管等病變和代謝功能紊亂。
二巰基丙醇(British anti-lewisite, BAL)可以解除這類抑制劑對巰基酶的抑制。

可逆性抑制劑與酶非共價結合

可逆性抑制劑與酶非共價可逆性結合，使酶活性降低或消失。採用透析、超濾或稀釋等物理方法可將抑制劑除去，使酶的活性恢復。可逆性抑制作用遵守米氏方程。

競爭性抑制劑與底物競爭結合酶的活性中心

抑制劑和酶的底物在結構上相似，可與底物競爭結合酶的活性中心，從而阻礙酶與底物形成中間產物，這種抑制作用稱為競爭性抑制作用(competitive inhibition) 。

非競爭性抑制劑結合活性中心之外的調節位點

有些抑制劑與酶活性中心外的結合位點相結合，不影響酶與底物的結合，底物也不影響酶與抑制劑的結合。底物和抑制劑之間無競爭關係，但 抑制劑-酶-底物複合物(IES)不能進一步釋放出產物。這種抑制作用稱為非競爭性抑制作用(non-competitive inhibition)。

反競爭性抑制劑的結合位點由底物誘導產生

與非競爭性抑制劑一樣，此類抑制劑也是與酶活性中心外的調節位點結合。不同的是，沒有底物結合時，游離的酶並不能與抑制劑結合，當底物與 酶結合後，酶才能與抑制劑結合。因此，抑制劑僅與酶底物複合物結合，使中間產物ES的量下降。這種抑制作用稱為反競爭性抑制作用(uncompetitive inhibition)。

激活劑可提高酶促反應速率

使酶由無活性變為有活性或使酶活性增加的物質稱為酶的激活劑(activator)。激活劑大多為金屬離子，如 Mg²⁺ ,K⁺ ,Mn²⁺等；少數為陰離子，如Cl^-。也有許多有機化合物激活劑，如膽汁酸鹽。
大多數金屬離子激活劑對酶促反應是不可缺少的，否則將測不到酶的活性。這類激活劑稱為酶的必需激活劑(essential activator)。必需激活劑參加酶與底物或與酶-底物複合物結合反應，但激活劑本身不轉化為產物。例如，已糖激酶催化的反應中，Mg²⁺與底物ATP結合生成Mg²⁺-ATP, 後者作為酶的真正底物參加反應。有些酶即使激活劑不存在時，仍有一定的催化活性，激活劑則可使其活性增加，這類激活劑稱為非必需激活劑(non-essential activator)。非必需激活劑通過與酶或底物或酶-底物複合物結合，提高酶的活性。例如，Cl^-是唾液澱粉酶的非必需激活劑。