生物化學與分子生物學/其他實驗技術/IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟

E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙醯基轉移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，後者與O序列結合，使操縱子（元）受阻遏而處於關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區，三個酶的編碼基因即由同一調控區調節，實現基因產物的協調表達。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處於阻遏狀態。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結合，抑制轉錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑並非乳糖本身。乳糖進入細胞，經b－半乳糖苷酶催化，轉變為半乳糖。後者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白，使蛋白構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定，因此被實驗室廣泛應用。

材料

誘導表達材料

LB （Luria—Bertani）)培養基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白腖 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用範圍：大腸桿菌

IPTG 貯備液：2 g IPTG溶於10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃ 保存。

l× 凝膠電泳加樣緩衝液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳級）

0.1 ％溴酚藍

10 ％甘油

大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

酶溶法

裂解緩衝液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

50 mmol / L 苯甲基磺醯氟（PMSF ）。

10 mg / mL 溶菌酶。

脫氧膽酸。
1 mg / mL DNase I。

超聲破碎法

TE 緩衝液。

2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩衝液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％溴酚藍

20 ％甘油

實驗方案

外源基因的誘導表達

用適當的限制性內切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
按連接步驟連接目的基因和載體，並轉化到相應的宿主菌。
篩選出含重組子的轉化菌落，提取質體DNA 作限制性內切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，確定無誤後進行下一步。
如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養數小時，使培養液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續培養3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養細菌數小時達到對數生長期後加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。
取上述培養液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉澱，加100 μL 聚丙烯醯胺凝膠電泳上樣緩衝液後，作SDS -PAGE 檢測。

大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化

細菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，並且方法① 、② 已在工業生產中得到應用，後三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。

酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為：
① 4 ℃ ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導表達的細菌培養液（100 mL ）。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩衝液，懸浮沉澱。