生物化學與分子生物學/其他實驗技術/大腸桿菌轉化實驗

大腸桿菌轉化可以

1. 將重組DNA分子導入大腸桿菌受體細胞進行複製，增殖和表達，以獲得目的基因；
2. 驗證大腸桿菌感受態細胞效果；
3. 用於分子生物學其他研究。

原理

質體DNA粘附在細菌細胞表面，經過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然後在非選擇培養基中培養一代，待質體上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養基中生長。

器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，乾式恆溫氣浴（或恆溫水浴鍋），製冰機，恆溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超淨工作檯，酒精燈，玻璃塗棒，恆溫培養箱。

材料和試劑

質體DNA，重組DNA，培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。

實驗準備

無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁製飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲醯胺配）。

操作步驟

1. 事先將恆溫水浴的溫度調到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰櫃中取出一管（100μl）感受態菌，立即用手指加溫融化後插入冰上，冰浴5~10min。
3. 加入5μl連接好的質體混合液（DNA含量不超過100ng），輕輕震盪後放置冰上20min。
4. 輕輕搖勻後插入42℃水浴中1~2min進行熱休克，然後迅速放回冰中，靜置3~5min。
5. 在超淨工作檯中向上述各管中分別加入500μl LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然後固定到搖床的彈簧架上37℃震盪1h.
6. 在超淨工作檯中取上述轉化混合液100~300μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻（注意：玻璃塗布棒上的酒精熄滅後稍等片刻，待其冷卻後再塗）。
7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液後再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻。
8. 在塗好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恆溫培養箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養基里後，再倒置過來放入37℃恆溫培養箱過夜。
9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦乾桌面，寫實驗報告。
10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。