生物化学与分子生物学/原核生物转录的模板和酶

RNA的合成 - 原核生物转录的模板和酶 - 原核生物的转录过程 - 真核生物RNA的合成 - 真核生物前体RNA的加工和降解
RNA的生物合成属于酶促反应，反应体系中需要DNA模板、NTP(包括ATP、UTP、CTP和GTP)、DNA依赖的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase, 简称RNA pol）、其他蛋白质因子及Mg²⁺等。 合成方向为5'→3',核苷酸间的连接方式为3',5'-磷酸二酯键。

原核生物转录的模板

在DNA分子双链上，一股链作为模板，按碱基配对规律指导转录生成RNA, 另一股链则不转录。用核酸杂交法对模板DNA和转录产物RNA进行测定，或对DNA、RNA的碱基进行序列测定，都可证明DNA分子上的一个基因只有一股链可转录生成其编码产物。
作为一个基因载体的一段DNA双链片段，转录时作为RNA合成模板的一股单链称为模板链(template strand), 相对应的另一股单链被称为编码链(coding strand)。转录产物若是mRNA, 则可用作翻译的模板，决定蛋白质的氨基酸序列。模板链既与编码链互补，又与mRNA互补，可见mRNA的碱基序列除用U代替T外，与编码链是一致的。文献刊出的各个基因的碱基序列，为避免繁琐和便于查对遗传密码，一般只写出编码链。

RNA聚合酶催化RNA合成

RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成

RNA pol催化RNA的转录合成。该反应以DNA为模板，以ATP、GTP、UTP和CTP为原料，还需要Mg²⁺作为辅基。RNA合成的化学机制与DNA的复制合成相似。RNA pol通过在RNA的3'-0H端加入核苷酸，延长RNA链而合成RNA。3'-0H在反应中是亲核基团，攻击所进入的核苷三磷酸的α-磷酸，并释放出焦磷酸，总的反应可以表示为：(NMP)_n+NTP→(NMP)_n+1+PPi。
RNA pol和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。 新加入的核苷酸以Watson-Crick碱基配对原则和模板的碱基互补。注意在此与DNA链中A配对的是U而不是T。
前述的DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在，而RNA pol能够在转录起点处使两个核苷酸间形成磷酸二酯键，即直接启动转录, 因而RNA链的起始合成不需要引物。

RNA聚合酶由多个亚基组成

大肠杆菌(E.coli)的RNA pol是目前研究得比较透彻的分子。这是一个分子量达450kD, 由5种亚基α₂(2个α)、β、β'、ω和σ组成的六聚体蛋白质。
核心酶(core enzyme)由α₂ββ'ω亚基组成。试管内的转录实验（含有模板、酶和底物NTP等）证明，核心酶能够催化NTP按模板的指引合成RNA。但合成的RNA没有固定的起始位点。加有σ（sigma）亚基的酶能在特定的起始点上开始转录，可见σ亚基的功能是辨认转录起始点。σ亚基加上核心酶称为全酶(holo-enzyme)。活细胞的转录起始，是需要全酶的。转录延长阶段则仅需核心酶。
大肠杆菌内有一些不同的RNA pol全酶，其差异是σ亚基的不同。目前已发现多种σ亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是σ70(分子量70kD)。σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质，大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别并激活。
将细菌从通常培养的37℃升温至42℃，细菌可迅速增加一套共17种蛋白质的合成。这些蛋白质被称为热激蛋白(heat shock proteins, HSP)。当温度升至50℃，大部分蛋白质合成已停止，HSP却能继续合成。HSP的编码基因称为热激基因(Hsp)。Hsp基因的转录起点的上游序列与其他基因不同，因而需另一种σ因子，即σ32(分子量32kD)辨认及启动其转录。可见，σ32是应答热刺激而被诱导产生的，它本身也属于一种 HSP。
其他原核生物的RNA pol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。抗生素——利福平(rifampicin)可以特异抑制原核生物的RNA pol, 成为抗结核菌治疗的药物。它特异性地结合RNA聚合酶的β亚基。若在转录开始后才加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这说明β亚基是在转录全过程都起作用的。

RNA聚合酶结合到启动子上启动转录

对于整个基因组来讲，转录是分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子中包括了若干个基因的编码区及其调控序列。调控序列中的启动子 (promoter)是RNA pol结合模板DNA的部位，也是决定转录起始点的关键部位。原核生物是以RNA pol全酶结合到启动子上而启动转录的，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。
启动子结构的阐明回答了转录从哪里起始这一问题，是转录机制研究的重要发现。为了确认RNA pol在基因组的结合位点，研究中采用了一种巧妙的方法，即RNA pol保护法。在实验中，先将提取的DNA与提纯的RNA pol混合温育一定时间，再加入核酸外切酶进行反应。结果显示，大部分DNA链被核酸酶水解为核苷酸，但一个40～60bp的DNA片段被保留下来。这段DNA没有被水解，是因为RNA pol结合在上面，因而受到保护。受保护的DNA位于转录起始点的上游，并最终被确认为是被RNA pol辨认和紧密结合的区域，是转录起始调节区。
对数百个原核生物基因操纵子转录上游区段进行的碱基序列分析，证明RNA pol保护区存在共有序列。以开始转录的5'-端第一位核苷酸位置转录起点(transcription start site, TSS; 或initiator)为+1，用负数表示其上游的碱基序号，发现-35和-10区A-T配对比较集中。-35区的最大一致性序列是TTGACA。-10区的一致性序列TATAAT ,是在 1975年由D.Pribnow发现的，故被称为Pribnow盒(Pribnow box)。-35区与-10区相隔16～18个核苷酸，-10区与转录起点相距6或7个核苷酸。
A-T配对相对集中，表明该区段的DNA容易解链，因为A-T配对只有两个氢键维系。比较RNA pol结合不同区段测得的平衡常数，发现RNA pol结合在-1 0区比结合在-35区更为牢固。把RNA pol分子大小与DNA链长度进行比较，可确定其结合DNA链时分子的跨度。从这些结果推论出：-35区是RNA pol对转录起始的识别序列(recognition sequence)。结合识别序列后，RNA pol向下游移动，达到Pribnow盒，与DNA形成相对稳定的RNA pol-DNA复合物，就可以开始转录。