細胞生物學/染色質與染色體

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染色質(chromatin)是間期細胞核中由DNA和組蛋白構成的能被鹼性染料着色的物質,是遺傳信息的載體。在細胞分裂間期,染色質成細絲狀,形態不規則,彌散在細胞核內;當細胞進入分裂期時,染色質高度螺旋、摺疊而縮短變租,最終凝集形成條狀的染色體(chromosome), 以保證遺傳物質DNA能夠被準確地分配到兩個子代細胞中。因此,染色質和染色體是細胞核內同一物質在細胞周期不同時相的不同表現形態。

染色質的組成成分

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染色質和染色體的組成成分主要是DNA和組蛋白,此外還含有非組蛋白及少量的RNA。DNA和組蛋白是染色質的穩定成分,兩者的比率接近1:1。非組蛋白的含量變動較大,常隨着細胞生理狀態的不同而改變。

DNA是遺傳信息的載體

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DNA分子是由數目巨大的腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶( T )四種脫氧核糖核苷酸通過3',5'-磷酸二酣鍵聚合而成的生物大分子。DNA分子呈雙螺旋結構,其兩條鏈的核苷酸序列按鹼基互補配對原則排列,即A對T,G對C。真核細胞中每條未複製的染色體均含有一條線型DNA分子。一個真核細胞單倍染色體組中所含的全部遺傳信息稱為一個基因組(genome)。
DNA的主要功能是攜帶和傳遞遺傳信息,並通過轉錄形成的RNA 來指導蛋白質合成。
真核細胞中染色質DNA序列根據其在基因組中分子組成的差異分為單一序列和重複序列兩大類型重複序列又分為中度重複序列和高度重複序列。
單一序列(unique sequence), 又稱單拷貝序列(single-copy sequence), 在基因組中一般只有單一拷貝或少數幾個拷貝。一般為具有編碼功能的基因。真核生物大多數編碼蛋白質(酶)的結構基因屬這種形式。
中度重複序列(moderately repetitive sequence), 其重複次數在101~105之間,序列長度由幾百到幾千個鹼基對(bp)不等。中度重複序列多數是不編碼蛋白的序列,構成基因內和基因間的間隔序列,在基因調控中起重要作用,涉及DNA複製、RNA轉錄及轉錄後加工等方面。在中度重複序列中,有一些是有編碼功能的基因,如rRNA基因,tRNA基因,組蛋白的基因、核糖體蛋白的基因等。
高度重複序列(highly repetitive sequence),其長度較短,一般為幾個至幾十個bp,但重複拷貝數超過105,分佈在染色體的端粒、着絲粒區。它們有些散在分佈,另一些則串聯重複,均不能轉錄,主要是構成結構基因的間隔,維繫染色體結構,還可能與減數分裂中同源染色體聯會有關。
一條功能性的染色質DNA分子必須能進行自我複製,得到兩個完全相同的DNA分子,並將其平均分配到子細胞中,保證遺傳信息的穩定傳遞。要達到這個目的,染色質DNA必須包含三類不同的功能序列: 複製源序列、着絲粒序列及端粒序列。①複製源序列(replication origin sequence):它是DNA進行複製的起始點。對於真核細胞來說,多個複製源序列可被成串激活,該序列處的DNA雙鏈解旋並打開,形成複製叉。因此,一條DNA分子上可同時在多個複製源序列處形成多個複製叉,使得DNA分子可在不同部位同時進行複製。根據不同來源的複製源序列分析,發現所有的複製源序列DNA均有一段11~14bp的同源性很高的富含AT的保守序列: 200bp-A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-200bp,同時證明這段序列及其上下游各200bp左右的區域是維持複製源功能所必需的。②着絲粒序列(centromere sequence): 着絲粒序列是真核生物在細胞分裂時,兩個姐妹染色單體連接的區域,根據不同來源的着絲粒序列分析,發現其共同特點是兩個彼此相鄰的核心區,一個是80~90bp的AT區,另一個是含有11個高度保守的鹼基序列:-TGATTTCCGAA-,功能是形成着絲粒,在細胞分裂時,兩個姐妹染色單體從着絲粒分離,保證均等分配兩個子代染色單體。通過着絲粒序列缺失損傷實驗或插入突變實驗,發現一旦傷及這兩個核心區,着絲粒序列即喪失其功能。③端粒序列(telomere sequence): 它存在於真核生物染色體的末端,在序列組成上十分相似,為一在進化中高度保守的串聯重複序列。雙鏈中一條3'端為富含TG序列,互補鏈富含CA的序列。端粒序列在維持DNA分子兩末端複製的完整性與染色體的穩定性方面發揮重要作用。採用分子克隆技術把真核細胞染色體的複製源序列、着絲粒序列、端粒序列分別克隆,並把它們相互拼接在一起構造成人工染色體,用於科學研究。

組蛋白是真核細胞染色質中的基本結構蛋白

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組蛋白(histone)是真核細胞染色質的基本結構蛋白質。組蛋白富含帶正電荷的精氨酸和賴氨酸等鹼性胺基酸,等電點一般在pH 10.0以上,屬鹼性蛋白質。用聚丙烯醯胺凝膠電泳可將組蛋白分離成5種,即Hl,H2A、H2B、H3、H4。5種組蛋白在染色質的分佈與功能上存在差異,可分為核小體組蛋白和連接組蛋白。
核小體組蛋白(nucleosomal histone)包括H2A、H2B、H3、H4四種,分子量較小,這類組蛋白之間有相互作用形成聚合體的趨勢,從而可將DNA捲曲形成核小體。核小體的組蛋白在進化上高度保守,無種屬及組織特異性,其中H3和H4是已知蛋白質中最為保守的,不同種屬間這兩種蛋白的一級結構高度相似,例如牛和豌豆的H4組蛋白的102個胺基酸殘基中僅有2個不同,海星與小牛胸腺的H4組蛋白僅有一個胺基酸不同,這一特點表明H3和H4的功能幾乎涉及它們所有的胺基酸, 以致其分子中任何胺基酸的改變都將對細胞產生影響。
H1組蛋白由215個胺基酸殘基組成,分子伍較大,為連接組蛋白。H1組蛋白在構成核小體時起連接作用,與染色質的高級結構的構建有關。H1組蛋白在進化中不如核小體組蛋白那麼保守,有一定的種屬特異性和組織特異性。在哺乳類細胞中,H1約有六種密切相關的亞型,胺基酸順序稍有不同。在成熟的魚類和鳥類的紅細胞中,H1被H5取代。
組蛋白在細胞周期的S期與DNA 同時合成。組蛋白在胞質中合成後即轉移到核內,與DNA結合,裝配形成核小體。組蛋白帶正電荷與DNA結合可抑制DNA的複製與RNA轉錄。但一些組蛋白的修飾可影響染色質的活性,這些修飾包括乙醯化、磷酸化和甲基化。當組蛋白某些胺基酸乙醯化或磷酸化後,則可改變組蛋白的電荷性質,降低組蛋白與DNA的結合,使DNA解旋從而有利於複製和轉錄的進行。而甲基化則可增強組蛋白與DNA的相互作用,降低DNA的轉錄活性。

非組蛋白能從多方面影響染色質的結構和功能

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非組蛋白(non-histone)是指細胞核中除組蛋白以外所有蛋白質的總稱,為一類帶負電荷的酸性蛋白質,富含天門冬氨酸、穀氨酸等。非組蛋白數量遠少於組蛋白,但其種類多且功能多樣,用雙向疑膠電泳可得到500多種不同組分,分子量一般在15 000~100 000之間。包括染色體骨架蛋白、調節蛋白及參與核酸代謝和染色質化學修飾的相關酶類。
非組蛋白有種屬和組織特異性,在整個細胞周期都能合成,其含量常隨細胞的類型及生理病理狀態不同而變化,一般功能活躍細胞的染色質中非組蛋白的含量高於不活躍細胞中的染色質。
非組蛋白的組分中含有啟動蛋白、DNA聚合酶、引物酶等,它們以複合物形式結合在某段DNA分子上,啟動和推進DNA分子的複製。有些非組蛋白是轉錄活動的調控因子,與基因的選擇性表達有關。非組蛋白作用於一段特異DNA序列上,能特異地解除組蛋白對DNA的抑制作用,以調控有關基因的轉錄。在染色質結構的「袢環」模型中,組蛋白把DNA雙鏈分子裝配成核小體串珠結構,非組蛋白則幫助DNA分子進一步盤曲摺疊,DNA袢環停泊在非組蛋白組成的支架上,構建成染色質的高級結構。

常染色質與異染色質

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根據間期核中染色質螺旋化程度以及功能狀態的不同,可分為常染色質(euchromatin)和異染色質(heterochromatin)。

常染色質是處於功能活躍呈伸展狀態的染色質纖維

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常染色質是指間期核中處於伸展狀態,螺旋化程度低,用鹼性染料染色淺而均勻的染色質。常染色質大部分位於間期核的中央,一部分介於異染色質之間。在核仁相隨染色質中也有一部分常染色質,往往以袢環的形式伸入核仁內。在細胞分裂期,常染色質位於染色體的臂。構成常染色質的DNA主要是單一DNA序列和中度重複DNA序列(如組蛋白基因和核糖體蛋白基因),常染色質具有轉錄活性,是正常情況下經常處於功能活性狀態的染色質,但並非常染色質的所有基因都具有轉錄活性,處於常染色質狀態只是基因轉錄的必要條件。

異染色質是處於功能惰性呈凝縮狀態的染色質纖維

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異染色質是指間期核中,螺旋化程度高,處於凝縮狀態,用鹼性染料染色時着色較深的染色質,一般位於核的邊緣或圍繞在核仁的周圍,是轉錄不活躍或者無轉錄活性的染色質。
異染色質可分為組成性異染色質(constitutive heterochromatin)和兼性異染色質(facultative heterochromatin)兩類。組成性異染色質又稱「恆定性異染色質」,是異染色質的主要類型。在各種類型細胞的細胞周期中(除複製期外)都呈凝縮狀態,是由高度重複的DNA序列構成,在分裂中期染色體上常位於染色體的着絲粒區、端粒區、次縊痕等部位;具有顯著的遺傳惰性,不轉錄也不編碼蛋白質;在複製行為上,較常染色質早聚縮晚複製。將培養的細胞進行同步化處理,在S期摻入3H胸腺嘧啶的實驗證明,組成性異染色質多在S期的晚期複製,而常染色質多在S期的早、中期複製。
兼性異染色質是指在生物體的某些細胞類型或一定發育階段,處於凝縮失活狀態,而在其他時期松展為常染色質。兼性異染色質的總量隨不同細胞類型而變化,一般胚胎細胞含量少,而高度分化的細胞含量較多,這就說明隨着細胞分化,較多的基因漸次以聚縮狀態關閉。因此,染色質的聚縮可能是關閉基因活性的一種途徑。例如,人類女性卵母細胞和胚胎發育早期,兩條X染色體均為常染色質;至胚胎發育的第16~18天,體細胞將隨機保持一條X染色體有轉錄活性,呈常染色質狀態;而另一條X染色體則失去轉錄活性,成為異染色質。在間期核中失活的X染色體呈異固縮狀態,形成直徑約1μm的濃染小體,緊貼核膜內緣,稱為X染色質或X小體。X染色質檢查可用於性別和性染色質異常鑑定。

染色質組裝形成染色體

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20世紀70年代以前,染色質一直被認為是由組蛋白包衷在DNA外,形成類似「鉛筆」狀的結構。1974年經R. D. Kornberg等人對染色質進行酶切降解研究及電鏡觀察後,人們對於染色質的結構才有了進一步的認識。現已知道,染色質的基本結構單位為核小體,核小體在串聯的基礎上,發生進一步摺疊、壓縮形成高級結構,最終組裝成染色體。

核小體為染色質的基本結構單位

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組成染色質的基本結構單位是核小體(nucleosome)。每個核小體包括有200個左右bp的DNA、8個組蛋白分子組成的八聚體及一分子組蛋白H1。八聚體是由四種組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩個分子組成,兩個H3、H4二聚體相互結合形成四聚體,位於核心顆粒中央,兩個H2A、H2B二聚體分別位於四聚體兩側。l46bp的DNA分子在八聚體上纏繞1.75圈,形成核小體的核心顆粒。在兩個相鄰的核小體之間以連接DNA(linker DNA)分子相連,典型長度約60bp,其長度變異較大,隨細胞類型不同而不同,其上結合一個組蛋白分子Hl,組蛋白Hl鎖定核小體DNA的進出端,起穩定核小體的作用。多個核小體形成一條念珠狀的纖維,直徑約為lOnm。
組蛋白與DNA之間的互相作用主要是結構性的,基本不依賴核甘酸的特異序列。實驗表明,核小體具有自裝配的性質。

核小體進—步螺旋形成螺線管

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由直徑10nm的核小體串珠結構進行螺旋盤繞,每6個核小體螺旋一周,形成外徑30nm, 內徑10nm的中空螺線管(solenoid), 組蛋白Hl位於螺線管內部,是螺線管形成和穩定的關鍵因素。螺線管為染色質的二級結構。在電鏡下觀察發現,大多數染色質以30nm染色質纖維形式存在。

螺線管進—步包裝成染色體

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關於DNA如何組裝成染色體,在一級及二級結構上已有直接實驗證據,並被大多數科學家認可。但從30nm的螺線管如何進一步組裝成染色體的過程尚存在爭議,目前主要有多級螺旋模型(multiple coiling model)及骨架-放射環結構模型(scaffold-radial loop structure model)得到較為廣泛的接受。
1、染色體多級螺旋模型 在該模型中,由螺線管進—步螺旋盤繞,形成直徑為400nm的圓筒狀結構,稱為超螺線管(super solenoid), 這是染色質組裝的三級結構。超螺線管再進一步螺旋、摺疊形成染色質的四級結構——染色單體。
根據多級螺旋模型,當DNA分子纏繞在直徑10nm的核小體核心顆粒上時,長度被壓縮7倍;直徑10nm的核小體形成螺線管後,DNA分子長度又被壓縮6倍;而當螺線管盤繞形成超螺線管時,DNA分子長度被壓縮約為40倍;超螺線管再度摺疊、纏繞形成染色單體後,DNA分子長度又將被壓縮5倍。因此,在染色質的組裝過程中,DNA分子在經過核小體、螺線管、超螺線管到染色單體四級連續螺旋、摺疊後,其長度共壓縮了8400倍。
2、染色體骨架——放射環結構模型 該模型認為螺線管以後的高級結構,是由30nm螺線管纖維摺疊成的拌環構成的,螺線管一端與由非組蛋白構成的染色體支架某一點結合,另一端向周圍呈環狀迂迴後又返回到與其相鄰近的點,形成一個個袢環圍繞在支架的周圍。每個DNA拌環長度約2lμm, 包含315個核小體。每18個袢環呈放射狀平面排列,結合在核骨架上形成微帶(miniband), 再由微帶沿縱軸縱向排列構建成為染色單體。
放射環模型最早是由U. K. Laemmli等(1977)根據大量的實驗結果提出的。他們用2mol/L的NaCl溶液加肝素處理HeLa細胞中期染色體,以去除組蛋白及大部分非組蛋白。電鏡下觀察染色體鋪展標本,看到由非組蛋白構成的染色體骨架,兩條染色單體的骨架相連於着絲粒區。由骨架的一點伸展出許多直徑30nm的染色質纖維構成的側環。若用EDTA處理染色體標本後,則可見30nm的纖維解螺旋,形成10nm的纖維。此外,實驗觀察發現,兩棲類卵母細胞的燈刷染色體和昆蟲的多線染色體,都含有一系列的袢環結構域(loop domain), 提示拌環結構可能是染色體高級結構的普遍特徵。
放射環模型較好地解釋了電鏡下觀察到的10nm及30nm纖維產生的結構形態,同時也說明了染色質中非組蛋白的作用。而且,袢環結構可能是保證DNA分子多點複製特性的高效性和準確性的結構基礎;也是DNA分子中基因活動的區域性和相對獨立性的結構基礎。

染色體的形態結構

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在細胞有絲分裂中期,因染色質高度凝集成染色體,此時染色體形態、結構特徵明顯,可作為染色體一般形態和結構的標準,常用於染色體研究及染色體病的診斷檢查。

着絲粒將兩條姐妹染色單體相連

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每一中期染色體都是由兩條相同的染色單體構成,兩條單體之間在着絲粒部位相連。彼此互稱為姐妹染色單體(sister chromatid)。
在中期染色體的兩姐妹染色單體連接處,存在一個向內凹陷的、淺染的縊痕,稱主縊痕(primary constriction)或初級縊痕。着絲粒(centromere)位於主縊痕內兩條姐妹染色單體相連處的中心部位。該結構由高度重複DNA序列的異染色質組成,並將染色單體分為兩個臂。着絲粒可作為一個重要標誌在染色體鑑別中起作用,中期染色體可根據着絲粒的位置,分為4種類型。

  • 中着絲粒染色體(metacentric chromosome): 着絲粒位於或靠近染色體中央,如將染色體全長分為8等份,則着絲粒位於染色體縱(長)軸的1/2~5/8之間,將染色體分成大致相等的兩臂。
  • 亞中着絲粒染色體(submetacentric chromosome):着絲粒位於染色體縱軸的5/8~7/8之間,將染色體分成長短不等的短臂(p)和長臂(q)。
  • 近端着絲粒染色體(acrocentric chromosome): 着絲粒靠近染色體的一端,位於染色體縱軸的7/8~近末端之間,短臂很短。
  • 端着絲粒染色體(telocentric chromosome): 着絲粒位於染色體的一端,形成的染色體只有一個臂。在人類正常染色體中沒有這種端着絲粒染色體,但在腫瘤細胞中可以見到。

着絲粒-動粒複合體介導紡錘絲與染色體的結合

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動粒(kinetochore)是由多種蛋白質組成的存在於着絲粒兩側的圓盤狀結構。每一中期染色體含有兩個動粒,是細胞分裂時紡錘絲微管附着的部位,與細胞分裂過程中染色體的運動密切相關。在細胞分裂後期,微管牽引着兩條染色單體向細胞兩極移動,動粒起着核心作用,控制着微管的裝配和染色體的移動。
着絲粒-動粒複合體(centromere-kinetochore complex)是由着絲粒與動粒共同組成的一種複合結構,兩者的結構成分相互穿插,在功能上緊密聯繫,共同介導紡錘絲與染色體的結合。它包括三種結構域:動粒域(kinetochore domain)、中心域(central domain)及位於中心域內表面的配對域(pairing domain)。
動粒域位於着絲粒的外表面,包括外、中、內三層式板狀結構的動粒和圍繞在動粒外層的纖維冠。動粒外層電子密度中等,厚約30~40nm, 是紡錘絲微管連接的位點;中層電子密度最低,呈半透明狀,無特定的結構,厚約15~60nm;內層電子密度高,厚約15~40nm, 與着絲粒中心域相聯繫。在沒有動粒微管存在時,外 層表面還可見覆蓋着一層由動力蛋白構成的纖維冠(fibrous corona), 是支配染色體運動和分離的重要結構。動粒域主要含有與動粒結構、功能相關的蛋白質,常為進化上高度保守的着絲粒蛋白(centromere protein, CENP)以及一些與染色體運動相關的微管蛋白、鈣調蛋白(CaM)、動力蛋白等。
中心域位於動粒域的內側,是着絲粒區的主體,由富含重複DNA序列的異染色質組成,能抗低滲膨脹和核酸酶消化。對着絲粒-動粒複合體結構的形成和正常功能活性的維待有重要作用。
配對域在中心域內表面,是有絲分裂中期姐妹染色單體相互作用的位點。該結構域分佈有兩類重要蛋白,即內着絲粒蛋白(inner centromere protein, INCENP)及染色單體連接蛋白(chromatid linking proteins, CLIPs)。在細胞分裂期,這些蛋白與姐妹染色單體的配對、分離有密切關係,伴隨着染色單體之間分離的發生,INCENP可遷移到紡錘體赤道區域,而CLIPs則會逐漸消失。
着絲粒動粒複合體的三種結構域在組成及功能上雖有區別,但當細胞進入有絲分裂時,它們彼此間需要相互配合、共同作用,才能確保有絲分裂過程中染色體與紡錘體的整合,為染色體的有序配對及分離提供了結構基礎。

次縊痕並非存在所有染色體上

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有些染色體的長、短臂上可見凹陷縮窄區,稱為次縊痕(secondary constriction), 次縊痕為染色體上除主縊痕外的淺染縊縮部位,為某些染色體所特有的形態特徵。次縊痕在染色體上的數目、位置及大小通常較恆定,可作為染色體鑑定的一種常用標記。

隨體是位於染色體末端的球狀結構

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人類近端着絲粒染色體短臂的末端,可見球狀結構,稱為隨體(satellite)。隨體通過柄部凹陷縮窄的次縊痕與染色體主體部分相連。隨體主要由異染色質組成,含高度重複DNA序列,其形態、大小在染色體上是恆定的,是識別染色體的重要形態特徵之一。有隨體染色體的次縊痕部位含有多拷貝rRNA基因(5S rRNA除 外),是具有組織形成核仁能力的染色質區,與核仁的形成有關,此區稱為核仁組織區(nucleolus organizing region, NOR)。

端粒是染色體末端的特化部分

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在染色體兩臂的末端由高度重複DNA序列構成的結構,稱為端粒, 它是染色體末端必不可少的結構。端粒有以下功能:①保證染色體末端的完全複製,端粒DNA 提供了複製線性DNA末端的模板;②在染色體的兩端形成保護性的帽結構,使DNA免受核酸酶和其他不穩定因素的破壞和影響,使染色體的末端不會與其他染色體的末端融合,保持染色體的結構完整;③在細胞的壽命、衰老和死亡以及腫瘤的發生和治療中起作用。在正常情況下,染色體末端彼此之間不發生融合,但當染色體發生斷裂而端粒丟失後,染色體的斷端可以彼此粘連相接,形成異常染色體。

核型與帶型

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核型(karyotype)是指一個體細胞中的全部染色體,按其大小、形態特徵順序排列所構成的圖像。將待測細胞的核型進行染色體數目、形態特徵的分析,稱為核型分析(karyotype analysis)。
根據染色體的長度和着絲粒的位置,將人類體細胞的46條染色體進行配對,順序排列編號,其中22對為男女所共有,稱為常染色體(autosomal chromosome), 編為1~22號,並分為A、B、C,D、E、F, G 7個組,A 組最大,G組最小。另一對隨男女性別而異,稱為性染色體(sex chromosome)。女性為XX染色體,男性為XY染色體。X染色體較大,為亞中着絲粒染色體,列入C組;Y染色體較小,為近端着絲粒染色體,列入G組。
按照國際標準,核型的描述包括兩部分內容,第一部分是染色體總數(包括性染色體),第二部分是性染色體組成,兩者之間用逗號隔開。正常女性核型描述為46,XX。正常男性核型描述為46,XY。
通常採用常規染色和顯帶染色技術來辨別染色體。常規染色方法所得到的染色體標本,除着絲粒和次縊痕外,整條染色體着色均勻,因此在核型分析中,除A組和E組外,組內各號染色體均難以準確鑑別。顯帶染色則能精確識別每一條染色體。
顯帶技術將染色體標本經過一定程序處理,並用特定染料染色,使染色體沿其長軸顯現出明暗或深淺相間、寬窄不等的橫行帶紋,構成了每條染色體的帶型。每對同源染色體的帶型基本相同且相對穩定,不同對染色體的帶型不同,因此通過顯帶染色體核型分析,除可準確地識別每條染色體外,還能檢測各條染色體的微小變化,如缺失、易位等,這大大提高了核型分析的精確度。
目前常用的染色體顯帶方法有G帶法、Q帶法、R帶法及高分辨顯帶等方法,這些方法可以恆定的顯示人體24條染色體的特異性帶型, 表明了帶型的客觀性和應用性,為識別染色體的改變提供技術分析基礎,為臨床上某些疾病的診斷和病因研究提供了有效的手段。