細胞生物學/受精與醫學

生殖細胞與受精 - 生殖細胞的起源與發生 - 受精與醫學
受精(fertilization)是精子與卵子融合形成受精卵的過程。成熟的精子和發育中的卵子（處於減數分裂Ⅱ中期的次級卵母細胞）如果不發生受精，將會在幾分鐘或數小時內死亡。受精挽救了精子和卵子，標誌着一個新生命的開始。受精與醫學關係極為密切，闡明受精的過程與機制，對解決臨床適齡婦女或男性的不育症及無害避孕有重要意義。

受精的條件

在哺乳動物和人類，受精一般發生在輸卵管壺腹部。因此，作為受精的條件，除取決於精子和卵子（次級卵母細胞）的發育成熟之外，性交後進入雌性生殖管道的精子必須獲得活力，即游動與受精的能力。
完成減數分裂變形階段的精子脫離睾丸的支待細胞，進入曲細精管的管腔中，而後開始遷移，依次通過直細精管、睾網、輸出小管進入附睾管和輸精管，在附睾尾和輸精管內儲存、成熟，直至射精。精子在附睾內受其分泌的甘油磷酸膽鹼、內毒鹼、唾液酸糖蛋白等作用下，逐漸達到功能上的成熟。研究發現，哺乳動物的精子進入雌性生殖管道後並不立即受精，而是停留一段時間，以獲得對卵子受精的能力，這一過程稱為精子的獲能(capacitation)。在人類，精子的獲能需要5～6小時。獲能後的精子表現為游動和細胞呼吸能力的增加，它們像衛星一樣圍繞着卵子細胞游動，其運動力的增加提高了精子與卵子細胞相互作用而接近的機率。性交後射出的3億個人精子中，只有200個能夠到達輸卵管的受精地點。有證據表明，排卵周酣的卵泡細胞釋放化學信號來吸引精子到達卵細胞，但這種化學信號的本質尚不清楚。
精子獲能的機制尚未完全闡明。一般認為它是由射精後精子所處的雌性生殖管道的液體環境所決定的，其獲能的本質是：精子因雌性生殖管道的「 特殊條件」而被改變。較多的實驗證據表明，在精子進入雌性生殖管道後，先由於某種未知的原因造成精子內部的鉀離子外流，引起質膜靜息電位發生變化，增加了質膜的不穩定性，致使膜膽固醇脫落，促使雌性生殖管道中的HCO₃^-和Ca²⁺進入精子細 胞，繼而激活了質膜上的腺苷酸環化酶，使精子細胞內cAMP水平升高，通過PKA激活胞內蛋白酪氨酸激酶，促使多種蛋白質產生磷酸化，從而提高了精子的代謝和運動能力，並使細胞膜處於超極化狀態。獲能也改變了精子細胞膜的脂質和糖蛋白的組分。例如，精液中含有唾液酸糖蛋白，並附着在精子頭部的外表面，阻止其頂體酶(acrosomal enzyme)的釋放；當精子在子宮和輸卵管中運動時，該糖蛋白被此處分泌物中唾液酸酶α和β澱粉酶等降解，使精子獲得授精能力。
雖然正常情況下獲能在雌性生殖道中發生，但也可用各種實驗條件離體誘發，這也是臨床上進行人工體外授精得以成功的基礎。運用合適的獲能液可以使受精在體外進行，並由此在體外受精中得到了廣泛應用。體外獲能的研究也促進了人類對精子獲能的認識。
精子的數量和質量是保證受精的條件之一。一次射精的精液中，精子總數大於4×l0⁷，其中能向前運動的大於50%, 精子形態正常的大於30%。受精雖然只由一個精子和一個卵子完成，但因精子與卵子的接觸有一定的隨機性，所以需要較多的精子到達輸卵管壺腹部，才能在限定時間內有正常精子完成與卵細胞的結合。

受精過程

在哺乳動物和入類，性交後，當獲能的精子與發育中的卵子（處於減數分裂Ⅱ中期的次級卵母細胞）相遇時，將引發系列連鎖反應，包括：精子識別卵細胞並誘發頂體反應，精子穿過卵外被抵達卵細胞膜，精-卵質膜融合後精子細胞核等成分進入卵細胞，次級卵母細胞完成減數分裂，皮層反應阻止多 精入卵，以及精-卵核融合等事件。精子與卵子的融合，標誌着一個新生命的開始。

精子識別卵細胞並穿過卵外被

1、精子-卵子識別誘發頂體反應 精子一旦獲能，便穿過卵泡細胞層，結合到透明帶。透明帶是受精的種屬屏障，去除透明帶就等於消除了這個屏障。例如，如果將大鼠卵子的透明帶經酶消化去除後，人類的精子就可以使其受精，當然，這樣的雜合子受精卵無法繼續發育。
哺乳動物卵子的透明帶主要由ZPl、ZP2和ZP3這3種糖蛋白質組成，它們均由生長中的卵母細胞產生。3種ZP蛋白在透明帶中的排列不是隨機的，ZP2和ZP3聚集成長絲狀，而ZPl則將這些長絲交聯在一起成為三維的網絡結構。在這三種蛋白中，ZPl僅具有結構功能，而ZP2和ZP3則同時參與配子間的相互作用。一般認為ZP3是精子與透明帶結合的主要受體，可以誘導頂體反應(acrosome reaction)；ZP2可作為經過頂體反應的精子的次級受體(secondary receptor)。ZP3受體的特異性由其肽鏈上的O-連接寡糖所決定。ZP3缺陷會導致雌性小鼠不育。
精子與卵細胞透明帶上的ZP3受體結合後，將觸發Ca²⁺向精子細胞質的內流，進而引發頂體反應，即精子的頂體成分通過胞吐作用被釋放出來，所釋放的多種水解酶可以消化卵子的透明帶，以幫助精子穿過透明帶；同時頂體反應也把精子中某些能與ZP2結合的蛋白質釋放到精子的表面，使精子在進入卵子過程中與透明帶緊密連接。在頂體反應期間，與ZP3結合的頂體前端發生胞吐作用，致使精子表面與ZP3結合的配體蛋白隨之丟失，精子必須繼續與透明帶結合才能完成穿透過程，此時是通過頂體內膜上的特殊蛋白與透明帶中的ZP2糖蛋白結合而實現的。這表明，頂體反應後精子與透明帶的結合由ZP3轉到ZP2,ZP2作為精子的次級受體進一步加固精子與透明帶的結合。
頂體反應是一種特殊的細胞胞吐過程。研究表明，精子中頂體的系列變化自獲能的精子接觸放射冠時即開始。獲能的精子首先與卵子周圍的放射冠接觸。這時精子頂體的前膜即與表面的細胞膜融合，繼而破裂形成許多小孔，頂體內含的酶（酸性水解酶）逐漸釋放出來。當精子與透明帶上的ZP3受體結合後，導致頂體破裂，內含物完全釋放。在精子接觸透明帶之前，卵丘細胞分泌的孕酮啟動頂體反應，而精子與透明帶結合後啟動頂體反應的是ZP3。如此，頂體反應中釋放的頂體酶先解離放射冠的卵泡細胞，繼而分解透明帶，形成一個精子穿過的通道。
2、精子穿過透明帶抵達卵細胞膜 在卵子的受精過程中，精子以種特異性的方式結合到透明帶上，從而完成頂體反應， 穿過透明帶到達質膜，精子與卵子細胞膜的直接接觸，標誌受精的開始。

精卵融合

1、精-卵質膜融合、精子細胞核等成分進入卵細胞 受精開始時，精子頭側面的細胞膜與卵細胞膜融合，隨即精子的細胞核和細胞質進入卵內。
掃描顯微鏡觀察發現，卵子細胞膜表面覆蓋有許多的微絨毛，精子首先作用於微絨毛頂端的細胞質膜，鄰近的微絨毛隨即迅速地伸長、聚叢，包繞着精子，從而保證精子與卵子緊密結合併發生質膜融合。當精子質膜與卵子質膜融合時，微絨毛被吸收，精子以頭部先入的方式進入卵子細胞質中。
精-卵質膜融合的機制至今尚不清楚。迄今人們在精子中的ADAM(a disintegrin and metalloprotease)家族成員和卵子細胞膜上的整聯蛋白(integrin)在精-卵質膜融合中的作用，進行了較多研究。研究發現，小鼠精子細胞膜上存在有ADAM家族成員受精素(fertilin)，它是在頂體反應後暴露於精子細胞表面的跨膜蛋白，能夠幫助精子結合到卵子質膜並促進精-卵質膜融合。受精素由兩個糖基化的跨膜亞單位α鏈和β鏈組成，它們之間以非共價鍵結合。受精素的細胞外N-端區域能夠同卵子質膜上的整聯蛋白(α6β1）結合，使精子黏附在卵子的表面以便為精-卵融合做準備。受精素α亞單位的胞外部分含有一個疏水區，它在結構上類似於介導病毒與感染細胞融合的病毒融合蛋白，該區域的人工合成多肽能夠誘導試管內的精-卵質膜融合。也有研究表明，受精素缺失的雄性鼠是不育的，它們的精子同卵子質膜的結合能力比正常的精子低8倍，與卵子融合的能力只有正常的50%。然而一些體外實驗發現，受精素缺失的精子仍然可以使卵子受精，這提示尚存在其他精子蛋白參與到精-卵質膜融合過程。
剔除基因lzumol 的小鼠是完全不育的，儘管這些小鼠的精子能夠穿過透明帶，但是不能與卵子融合形成受精卵，提示lzumol 是精-卵融合所必需的。進一步的實驗標明，lzumo突變的精子與活化的卵子融合併不影響合子的發育。睾丸生殖細胞特異表達的Tssk6(testis-specific serine kinase6)的基因剔除小鼠，其精子不能結合透明帶，對lzumol蛋白在精子中的分佈也無調節作用。
新近發現，卵細胞膜上的整聯蛋白相關蛋白CD9在精-卵質膜融合中起重要作用。
2、次級卵母細胞完成減數分裂過程 精子進入卵子後，激發次級卵母細胞迅速完成第二次減數分裂，形成一個成熟的卵子和一個第二極體，卵子細胞單倍染色體向中央移行，核膜形成，形成雌原核(female pronucleus)。精子進入卯後，核膜崩潰，尾部退化消失，細胞染色質解聚，核內精蛋白被組蛋白替換，新形成的原核膜包在染色質外周，形成雄原核(male pronucleus)。
3、精-卵膜融合後發生皮層反應阻止多精入卵 雖然有許多精子可以與卵子結合，但通常只有一個精子能夠與卵子的胞膜融合併向卵子細胞質內釋放出它的細胞核和其他細胞器。如果有多餘一個的精子與卵子融合，則稱為多精入卵(polyspermy), 此時多極或過多的紡錘體形成，將導致細胞分裂時染色體的錯誤分配、非二倍體細胞的產生以及發育的停滯。迄今研究表明，有兩個調控機制可以確保只有一個精子與卵子結合。一是卵子與第一個精子融合後將引起卵子質膜的快速去極化，以阻止其他精子與已受精卵子的融合，這是一個快速的早期阻止多精入卵的機制。但卵子質膜的極性在受精作用後很快恢復正常，因此需要另外一個作用時間長的機制來阻止多精入卵，這就是卵子的皮層反應(cortical reaction), 即卵子通過胞吐作用將其皮質顆粒釋放出來，改變卵外被結構。哺乳動物的研究表明，皮層顆粒中的糖昔酶降解透明帶中的ZP3為ZP3f，ZP3f缺少糖基，致使精子膜表面蛋白無法識別；皮層顆粒中的蛋白酶降解ZP2為ZP2f,ZP2f不能與頂體反應精子結合，使多餘的精子不能進入，從而阻止多精入卵。
卵子細胞中儲存的Ca²⁺的釋放與皮層反應直接相關。精子與卵子的質膜融合，將激活胞內內質網上存在的Ca²⁺通道，引起儲存Ca²⁺的釋放，導致卵子局部細胞質內游離Ca²⁺濃度的增加，並形成鈣波(calcium wave)傳播到整個卵子，啟動皮層反應。
在卵子發生過程中，透明帶蛋白是泛素化的。用泛素蛋白酶體抑制劑處理卵子，可阻止精子進入卵子的透明帶，表明去泛素化也可阻止多精入卵。

精-卵核融合完成受精過程

卵子一旦受精後即為合子。只有當兩個單倍體的細胞核（雄原核和雌原核）融合在一起，並且它們的染色體「混合」成為一個二倍體的細胞核時，受精過程才算完成。在哺乳動物，受精卵內的兩個原核並不像其他物種那樣直接融合，它們彼此接近但是保持距離，這種狀態一直持續到合子細胞準備進行第一次有絲分裂（即卵裂）時為止。此時，在卵子胞質中的微管和微絲作用下，雌原核、雄原核相互靠近，接觸處原核膜呈指狀，相互交錯對插；同時染色體濃縮，原核膜崩解、消失，精-卵染色體組合在一起，形成合子染色體組，定位於紡錘體上。此時細胞即為受精卵，受精至此完成。
多數動物（包括人類）在受精時，精子為合子提供的不僅僅是DNA, 它還提供中心粒（在人類未受精的卵子裏不存在）。精子中心粒伴隨着細胞核和尾端進入卵子，並在其周圍形成中心體。在人類，精子中心粒進行複製並且組織合子細胞第一次有絲分裂的紡錘體裝配。這也解釋了在多精入卵時為什麼有多極現象和多餘的紡錘體形成（由於多個精子的中心粒進入卵子）。
受精具有重要意義：①受精使卵子的緩慢代謝轉入代謝旺盛期，從而啟動細胞不斷地分裂；②精子與卵子的結合，恢復了二倍體，維持物種的穩定性；③受精決定性別，帶有Y染色體的精子與卵子結合發育為男性，帶有X染色體的精子與卵子結合則發育為女性；④受精的染色體來自父母雙方，加之生殖細胞在成熟分裂時曾發生染色體聯會和片斷交換，使遺傳物質重新組合，使新個體具有與親代不完全相同的性狀。

輔助生殖技術

在臨床工作中發現，一些適齡婦女或男性患有不育症，這為患者本人及其家庭帶來巨大痛苦。目前受精過程及其機制的研究成果在臨床上的應用，為患者及其家庭帶來了福音。這得益於輔助生殖技術(assisted reproductive technology, ART)。ART是指應用現代生物醫學知識、技術及方法對配子、合子及胚胎進行人工操作，代替人類自然生殖過程中的某些步驟，以達到受孕目的的一項技術，主要包括體外受精、胚胎移植及其衍生技術。輔助生殖技術的應用不僅從技術上解決了長期困惑醫學界的不孕不育難題，也給無數家庭帶來了歡樂。
迄今輔助生殖技術已催生出四代試管嬰兒：
(1)第一代試管嬰兒：1978年，英國學者利用體外受精(in vitro fertilization, IVF)技術，產生了世界上第一例試管嬰兒。體外受精是指分別將卵子與精子取出後，置於試管內使其受精，經過數天的生長後（卵裂期或囊胚期），再將胚胎移植(embryo transfer, ET)到母體子宮內發育成胎兒並分挽的技術，該技術統稱為常規IVF-ET，最終分挽的嬰兒稱為試管嬰兒（第一代試管嬰兒）。該成果在2010年獲得諾貝爾醫學獎。IVF-ET的適用範圍是：①因女性因素所致不孕問題，如各種原因導致的輸卵管不通或功能障礙（輸卵管切除、輸卵管阻塞、盆腔嚴重粘連及輸卵管結紮再通術失敗等）；②男方少、弱精子症；③不明原因的不育；④免疫性不孕等。IVF-ET的受精率只有30%～40%。
(2)第二代試管嬰兒：1992 年，比利時研究人員成功應用了卵胞質內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術，即藉助顯微作業系統將單一精子注射入卵子內使其受精。1994 年，世界上第一例「ICSI嬰兒」（第二代試管嬰兒）出生。ICSI技術可以解決常規IVF-ET成功率不高的問題，受精率可達50%～70%, 提高了IVF的成功率。ICSI技術僅需數個精子就可以達到受精、妊娠，是嚴重男性因素不育患者的最有效治療方法。它是適用於男性少、弱精子症患者，以及圓頭（頂體缺乏）精子或完全不活動精子等。ICSI的成功率很大程度上受精子質量和顯微操作技術的影響。ICSI潛在的問題可能是精子的表觀遺傳「程度」不夠。ICSI和IVF是男性不育症的最有效治療方法，嬰兒活產率為20%～25%。自1996年第一對夫婦成功使用卵漿內單精子顯微注射術誕下一女嬰後，卵漿內單精子注射術受到了全世界的關注。
(3)第三代試管嬰兒：胚胎移植前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)技術是用於解決人類遺傳病而發展的一項技術。在受精卵分裂到6～8個細胞的時候，對透明帶打孔後，取出一個細胞進行PGD, 選擇正常的胚胎植入子宮，避免父母有遺傳性疾病的遺傳缺陷嬰兒的出生，達到優生的目的。世界上第一例經過PGD的嬰兒（第三代試管嬰兒）於1990年出生。PGD技術主要解決的是：①夫妻中一人可能攜帶了遺傳病基因或異常染色體，想確定自己的後代將來是否會受到該基因的影響；②夫妻雙方想要確定，自己是否攜帶了異常染色體以至於不能正常懷孕。
(4)第四代試管嬰兒：有些女性雖然有排卵功能，但是身體條件不好，或年齡偏大，致使卵子質量不高、活力差、線粒體異常等，不適合使用上述技術。這時可從新鮮的卵子抽出細胞質，輸入另一位健康女性卵細胞質形成一個新的優質卵細胞，將此新的卵子與其丈夫精子結合成受精卯，植入子宮內，妊娠分挽。此技術稱為卵漿置換(exchange of cytoplasmic and nucleus)技術（第四代試管嬰兒）。
目前，世界上已普遍開展了精子和胚胎的冷凍和復融技術，而卵子的冷凍和復融成功率較低，正在探索中。國內現在大部分IVF實驗室也相繼建立了精子及胚胎凍融技術。
ART有利於解決不孕症，但也引發許多倫理問題，如生育與性行為的分離，傳統家庭模式的解體，親子關係的破裂，代孕母親的利弊，精子庫、卵子庫的功過、胚胎的地位、服務分配的公正、輔助生殖技術與領養孤兒的倫理衝突，知情同意和保密，兒童的身心健康，等等。