生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/touchdown-PCR

降落PCR（touchdown PCR），一種PCR技術，主要用於PCR的條件的優化。在許多情況下引物的設計使得PCR難以進行，例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低，但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。

實驗材料：基因樣品

儀器、耗材：PCR儀

實驗步驟：

1. 反應體積為50 μl。
2. 人CD137胞膜外區基因的PCR擴增體系：CD137-pCDNA3質體4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。
3. hIgG1Fc片段的PCR擴增體系：含人hIgG1Fc的PGEM-T質體4 μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。
4. HBVDNA多聚酶基因的PCR擴增體系：
   • 第一輪：HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.
   • 第二輪：取5倍稀釋的第一輪PCR產物4μl為模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。
5. 分別在各滅菌PCR管加入上述各反應成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混勻，離心，PCR程序如下：
   • 94度預變性5分鐘，
   • 94度變性30秒，62度（Tm若為55度）退火30秒，72度延伸1分鐘。
   • 以後每2個循環依次降低退火溫度2度，直到50度，共15個循環。
   • 94度變性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分鐘。
   • 15－20個循環後。
   • 72度延伸5分鐘。
6. 取 10 μl PCR 擴增產物，在2%或3%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察擴增產物。

注意事項：

由於目標是在較早的循環中避免低Tm值配對，在TD—PCR中最好應用熱啟動技術。設計時，退火溫度的範圍應跨越15℃左右，從高於估計Tm值至少幾度到低於它10℃