生物化學與分子生物學/DNA損傷修復

DNA損傷和損傷修復 - DNA損傷 - DNA損傷修復 - DNA損傷及其修復的意義
在生命的各種活動中，生物體發生DNA損傷不可避免。這種損傷所導致的結局取決於DNA損傷的程度，以及細胞對損傷DNA的修復能力。DNA損傷修復是指糾正DNA兩條單鏈間錯配的鹼基、清除DNA鏈上受損的鹼基或糖基、恢復DNA的正常結構的過程。DNA修復(DNA repair)是機體維持DNA結構的完整性與穩定性，保證生命延續和物種穩定的重要環節。
細胞內存在多種修復DNA損傷的途徑或系統。常見的DNA損傷修復途徑或系統包括，直接修復、切除修復、重組修復和損傷跨越修復等。值得注意的是，一種DNA損傷可通過多種途徑修復，而一種修復途徑也可同時參與多種DNA損傷的修復過程。

有些DNA損傷可以直接修復

直接修復是最簡單的一種DNA損傷的修複方式。修復酶直接作用於受損的DNA,將之恢復為原來的結構。

嘧啶二聚體的直接修復 嘧啶二聚體的直接修復又稱為光復活修復或光復活作用。生物體內存在着一種DNA光裂合酶(DNA photolyase), 能夠直接識別和結合於DNA鏈上的嘧啶二聚體部位。在可見光(400nm)激發下，光復活酶可將嘧啶二聚體解聚為原來的單體核苷酸形式，完成修復。DNA光裂合酶最初在低等生物中發現，有兩個與吸收光子有關的生色基團，次甲基四氫葉酸和FADH₂。次甲基四氫葉酸吸收光子後將FAD比激活，再由激活的FADH₂將電子轉移給嘧啶二聚體，使其還原。鳥類等高等生物雖然也存在DNA光裂合酶，但是光復活修復並不是高等生物修復嘧啶二聚體的主要方式。哺乳動物細胞缺乏DNA光裂合酶。
烷基化喊基的直接修復 催化此類直接修復的酶是一類特異的烷基轉移酶，可以將烷基從核苷酸直接轉移到自身肽鏈上，修復DNA的同時自身發生不可逆轉的失活。比如，人類O⁶-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶，能夠將O⁶位的甲基轉移到酶自身的半胱氨酸殘基上，使甲基化的鳥嘌呤恢復正常結構。
單鏈斷裂的直接修復 DNA連接酶能夠催化DNA雙螺旋結構中一條鏈上缺口處的5'-磷酸基團與相鄰片段的3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而直接參與DNA單鏈斷裂的修復，如電離輻射所造成DNA單鏈上的切口。

切除修復是最普遍的DNA損傷修複方式

切除修復是生物界最普遍的一種DNA損傷修複方式。通過此修複方式，可將不正常的鹼基或核苷酸除去並替換掉。依據識別損傷機制的不同，又分為鹼基切除修復和核苷酸切除修復兩種類型。

鹼基切除修復

鹼基切除修復(base excision repair，BER)依賴於生物體內存在的一類特異的DNA糖苷酶。整個修復過程包括：①識別水解：DNA糖苷酶特異性識別DNA鏈中已受損的鹼基並將其水解去除，產生一個無鹼基位點；②切除：在此位點的5'-端，無鹼基位點核酸內切酶將DNA鏈的磷酸二酯鍵切開，同時去除剩餘的磷酸核糖部分；③合成：DNA聚合酶在缺口處以另一條鏈為模板修補合成互補序列；④連接：由DNA連接酶將切口重新連接，使DNA恢復正常結構。
抑癌蛋白p53在哺乳動物細胞中參與調控鹼基切除修復。直接證據是 DNA 烷化劑誘導的DNA損傷，在表達野生型p53的細胞可被有效修復，而在p53缺失的細胞，其修復速度明顯減慢。

核苷酸切除修復

與鹼基切除修復不同，核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)系統並不識別具體的損傷，而是識別損傷對DNA雙螺旋結構所造成的扭曲，但修復過程與鹼基切除修復相似。首先，由一個酶系統識別DNA損傷部位；其次，在損傷部位兩側切開DNA鏈，去除兩個切口之間的一段受損的寡核苷酸；再次，在DNA聚合酶作用下，以另一條鏈為模板，合成一段新的DNA, 填補缺損區；最後由連接酶連接，完成損傷修復。
切除修復是DNA損傷修復的一種普遍形式，它並不局限於某種特殊原因造成的損傷，而能一般性地識別和糾正DNA鏈及DNA雙螺旋結構的變化，修復系統能夠使用相同的機制和一套修復蛋白質去修復一系列性質各異的損傷。
人類的DNA損傷核背酸切除修復需要大約30多種蛋白質的參與。其修復過程如下：①由損傷部位識別蛋白XPC和XPA等，再加上DNA複製所需的SSB，結合在損傷DNA的部位；②XPB和XPD發揮解旋酶的活性，與上述蛋白質共同作用在受損DNA周圍形成一個凸起；③XPG與XPF發生構象改變，分別在凸起的3'-端和5'-端發揮核酸內切酶活性，在增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的幫助下，切除並釋放受損的寡核苷酸；④遺留的缺損區由DNA聚合酶σ或ε進行修補合成；⑤由連接酶完成連接。
核苷酸切除修復不僅能夠修復整個基因組中的損傷，而且能夠修復那些正在轉錄的基因模板鏈上的損傷，後者又稱為轉錄偶聯修復(transcription-coupled repair), 因此，更具積極意義。在此修復中，所不同的是由RNA聚合酶承擔起識別損傷部位的任務。

鹼基錯配修復

錯配是指非Watson-Crick鹼基配對。鹼基錯配修復也可被看作是鹼基切除修復的一種特殊形式，是維持細胞中DNA結構完整穩定的重要方式，主要負責糾正以下錯誤：

複製與重組中出現的鹼基配對錯誤；
因鹼基損傷所致的鹼基配對錯誤；
鹼基插入；
鹼基缺失。

從低等生物到高等生物，均擁有保守的鹼基錯配修復系統或途徑。
大腸桿菌參與DNA複製中錯配修復的蛋白質包括Mut(mutase)H、MutL、MutS、DNA解旋酶、單鏈DNA結合蛋白、核酸外切酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅲ，以及DNA連接酶等10餘種蛋白質或相關酶成分，修復過程十分複雜。修復過程中面臨的主要問題是如何區分母鏈和子鏈。在細菌DNA中甲基化修飾是一個重要標誌，母鏈是高度甲基化的，主要是其腺嘌呤A發生甲基化修飾，而新合成子鏈中的腺嘌呤A的甲基化修飾尚未進行，這提示錯配修復應在此鏈上進行。首先由MutS蛋白識別錯配鹼基，隨後由MutL和MutH等蛋白質協同相應的核酸外切酶，將包含錯配點在內的一小段DNA水解、切除，經修補、連接後，恢復DNA正確的鹼基配對。
繼細菌錯配修復機制被揭示之後，真核細胞的錯配修復機制的研究，近年來也取得很大進展。現已發現多種與大腸桿菌的MutS和MutL高度同源的參與錯配修復的蛋白質，如與大腸桿菌MutS高度同源的人類的MSH2(MutS Homolog 2)、MSH6和MSH3等。MSH2和MSH6的複合物可識別包括鹼基錯配、插入、缺失等DNA損傷，而由MSH2和MSH3形成的蛋白質複合物則主要識別鹼基的插入與缺失。真核細胞並不像原核細胞那樣以甲基化來區分母鏈和子鏈，可能是依賴修復酶與複製複合體之間的聯合作用識別新合成的子鏈。

DNA嚴重損傷時需要重組修復

雙鏈DNA分子中的一條鏈斷裂，可被模板依賴的DNA修復系統修復，不會給細胞帶來嚴重後果。然而，DNA分子的雙鏈斷裂是一種極為嚴重的損傷。與其他修複方式不同的是，雙鏈斷裂修復由於沒有互補鏈可言，因此難以直接提供修復斷裂所必需的互補序列信息。為此，需要另外一種更為複雜的機制，即重組修復來完成DNA雙鏈斷裂的修復。重組修復是指依靠重組酶系，將另一段未受損傷的DNA移到損傷部位，提供正確的模板，進行修復的過程。依據機制的不同，重組修復可分為同源重組修復和非同源末端連接重組修復。

同源重組修復

同源重組修復(homologous recombination repair)指的是參加重組的兩段雙鏈 DNA 在相當長的範圍內序列相同(≥200bp),這樣就能保證重組後生成的新區序列正確。大腸桿菌同源重組的分子機制已比較清楚，起關鍵作用的是 RecA 蛋白，也被稱作重組酶，它是一個由352個胺基酸組成的蛋白質。多個RecA單體在DNA上聚集，形成右手螺旋的核蛋白細絲，細絲中具有深的螺旋凹槽，可以識別和容納 DNA 鏈。在 ATP 存在的清況下，RecA 可與損傷的 DNA 單鏈區結合，使 DNA 伸展，同時 RecA 可識別一段與受損 DNA 序列相同的姐妹鏈，並使之與受損 DNA 鏈並列排列，交叉互補，並分別以結構正常的兩條 DNA 鏈為模板重建損傷鏈。最後在其他酶的作用下，解開交叉互補，連接新合成的鏈，完成同源重組。同源重組生成的新片段具有很高的忠實性。

非同源末端連接的重組修復

非同源末端連接重組修復(non-homologous end joining recombination repair)是哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂的一種修複方式，顧名思義，即兩段DNA鏈的末端不需要同源性就能相互替代連接。因此，非同源末端連接重組修復的DNA鏈的同源性不高，修復的DNA序列中可存在一定的差異。對於擁有巨大基因組的哺乳動物細胞來說，發生錯誤的位置可能並不在必需基因上，這樣依然可以維持受損細胞的存活。非同源末端連接重組修復中起關鍵作用的蛋白質分子是DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK), 是一種核內的絲氨酸/氨酸蛋白激酶，由一個分子量大約為465kD的催化亞基(DNA-PKcs)和一個能結合DNA游離端的雜二聚體蛋白Ku組成。DNA-PKcs的作用是介導DNA-PK的催化功能，而Ku蛋白可與雙鏈DNA的斷端連接，促進雙鏈斷裂的重接。
另一個參與非同源末端連接重組修復的重要蛋白質是XRCC4(X-ray repair, complementing defective, in Chinese hamster), 它能與DNA連接酶形成複合物，增強連接酶的活力，在DNA連接酶與組裝在DNA末端的DNA-PK複合物相結合的過程中起中間體作用。非同源末端連接重組修復既是修復DNA損傷的一種方式，又可以被看作是一種生理性基因重組的策略，將原來並未連在一起的基因或片段連接產生新的組合，如B淋巴細胞、T淋巴細胞的受體基因、免疫球蛋白基因的構建與重排等。

跨越損傷DNA合成是一種差錯傾向性DNA損傷修復

當DNA雙鏈發生大範圍的損傷，DNA損傷部位失去了模板作用，或複製叉已解開母鏈，致使修復系統無法通過上述方式進行有效修復，此時，細胞可以誘導一個或多個應急途徑，通過跨過損傷部位先進行複製，再設法修復。而根據損傷部位跨越機制的不同，這種跨越損傷DNA的修復又被分為重組跨越損傷修復與合成跨越損傷修復兩種類型。

重組跨越損傷修復

當DNA鏈的損傷較大，致使損傷鏈不能作為模板複製時，細胞利用同源重組的方式，將DNA模板進行重組交換，使複製能夠繼續下去。然而，在大腸桿菌中，還有某些新的機制，當複製進行到損傷部位時，DNA聚合酶Ⅲ停止移動，並從模板上脫離下來，然後在損傷部位的下游重新啟動複製，從而在子鏈DNA上產生一個缺口。RecA重組蛋白將另一股健康母鏈上對應的序列重組到子鏈DNA的缺口處填補。通過重組跨越，解決了有損傷的DNA分子的複製問題，但其損傷並沒有真正地被修復，只是轉移到了另一個新合成的一個子代的DNA分子上，由細胞內其他修復系統來後繼修復。

合成跨越損傷修復

當DNA雙鏈發生大片段、高頻率的損傷時，大腸桿菌可以緊急啟動應急修復系統，誘導產生新的DNA聚合酶(DNA聚合酶Ⅳ或Ⅴ), 替換停留在損傷位點的原來的DNA聚合酶Ⅲ，在子鏈上以隨機方式插入正確或錯誤的核昔酸使複製繼續，越過損傷部位之後，這些新的 DNA聚合酶完成使命後從DNA鏈上脫離，再由原來的DNA聚合酶Ⅲ繼續複製。因為誘導產生的這些新的DNA聚合酶的活性低，識別鹼基的精確度差，一般無校對功能，所以這種合成跨越損傷複製過程的出錯率會大大增加，是大腸桿菌SOS反應或SOS修復的一部分。
在大腸桿菌等原核細胞中，SOS修復反應是由RecA蛋白與LexA阻遏物的相互作用引發的，有近30個SOS相關基因編碼蛋白質參與此修復反應。正常情況下，RecA基因以及其他的SOS相關的可誘導基因的上游，有一段共同的操縱序列(5'-CTG-N10-CAG-3')被LexA阻遏蛋白所阻遏，只有低水平的轉錄和翻譯，產生少量的相應蛋白質。當DNA嚴重損傷時，RecA蛋白表達，激活LexA的自水解酶活性當LexA阻遏蛋白因水解從RecA基因，以及SOS相關的可誘導基因的操縱序列上解離下來後，一系列受LexA阻遏的基因得以表達，參與SOS修復活動。完成修復後，LexA阻遏蛋白重新合成，SOS相關的可誘導基因重新關閉。需要指出的是，SOS反應誘導的產物可參與重組修復、切除修復和錯配修復等修復過程。這種修復機制因海空緊急呼救信號"SOS"而得名。
此外，對於受損的DNA分子，除了啟動上述諸多的修復途徑，以修復損傷之外，細胞還可以通過其他的途徑將損傷的後果降至最低。例如，通過DNA損傷應激反應活化的細胞周期檢查點機制，延遲或阻斷細胞周期進程，為損傷修復提供充足的時間，誘導修復基因轉錄翻譯，加強損傷的修復，使細胞能夠安全進入新一輪的細胞周期。與此同時，細胞還可以激活凋亡機制，誘導嚴重受損的細胞凋亡，在整體上維持生物體基因組的穩定。