生物化學與分子生物學/線粒體氧化體系與呼吸鏈

生物氧化 - 線粒體氧化體系與呼吸鏈 - 氧化磷酸化與ATP的生成 - 氧化磷酸化的影響因素 - 其他氧化與抗氧化體系
線粒體氧化體系的主要功能是為機體提供能量，包括熱能、ATP等。在線粒體內，糖、脂肪、蛋白質等營養物質在被徹底氧化分解為CO₂和H₂O的過程中釋放能量，但其氧化過程需要在酶的催化下逐步進行，能量也不會在瞬間大量釋放產生高溫、高熱，而是逐漸釋放並儲存在ATP中。營養物質被氧化時常發生脫氫反應，脫下來的氫(H⁺+e^-）以NADH+H⁺(簡寫為NADH)、FADH₂等形式存在。 NADH和FADH₂在線粒體被氧化時，需要一系列的酶催化，逐步脫氫、失電子，最終將電子和H⁺傳遞給氧而生成水，同時釋放能量用於生成ATP。因此，線粒體需要多種具有傳遞氫和電子的組分參與氧化還原反應。

線粒體氧化體系含多種傳遞氫和電子的組分

底物脫氫和失去電子是生物氧化的基本化學過程。能夠傳遞氫和電子的物質，如金屬離子、小分子有機化合物、某些蛋白質等稱之為遞電子體或遞氫體。線粒體氧化體系主要將NADH和FADH₂中的H⁺和電子傳遞給氧，參與其過程的遞氫體和遞電子體如下。

煙醯胺腺嘌呤核苷酸傳遞氫和電子

煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺), 通過煙醯胺環傳遞H⁺和電子。煙醯胺環的五價氮原子，能接受2H中的雙電子成為三價氮，為雙電子傳遞體，同時芳環接受一個H⁺進行加氫反應。由於此反應只能接受l個H⁺和2個電子，游離出一個H⁺在介質中，因此將還原型的NAD⁺寫成NADH+H⁺(簡寫為NADH)。NAD⁺是許多脫氫酶的輔酶，有傳遞氫和電子的功能。此外，NAD⁺結構中核糖的2位羥基被磷酸化後生成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP⁺)。NADP⁺通過相同的機制接受氫後生成NADPH+H⁺，發揮傳遞氫和電子的作用，但參與不同的反應。

黃素核苷酸衍生物傳遞氫和電子

黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)是維生素B₂與核苷酸形成的有機化合物，兩者均通過維生素B₂中的異咯嗪環進行可逆的加氫和脫氫反應。異咯嗪環可接受l個H⁺和l個電子形成不穩定的FMNH^·和FADH^·,再接受l個H⁺和一個電子轉變為還原型FMNH₂和FADH₂。因此FMN、FAD發揮傳遞氫和電子的作用, 是黃素蛋白(flavoprotein)的輔基。

有機化合物泛醌傳遞氫和電子

泛醌(ubiquinone)又稱輔酶Q(coenzyme Q, CoQ或Q)，是一種脂溶性醌類化合物，其結構中異戊二烯單位的數目因物種而異，人體內的Q是10個異戊二烯單位連接的側鏈，用Q₁₀表示。Q的疏水特性使其能在線粒體內膜中自由擴散。Q結構中的苯醌部分接受l個電子和1個H⁺還原為半醌(QH^·），再接受1個電子和1個H⁺還原為二氫泛醌(QH₂)。反之，QH₂可逐步失去H ⁺和電子被氧化為Q。因此Q可進行雙、單電子的傳遞。

鐵硫蛋白和細胞色素蛋白傳遞電子

鐵硫蛋白(iron-sulfur protein), 因其含有鐵硫中心(iron-sulfur center, Fe-S center)而得名。Fe-S是Fe離子通過與無機硫(S)原子及鐵硫蛋白中半胱氨酸殘基的SH連接而成。Fe-S有多種形式，可以是單個Fe離子與4個半胱氨酸殘基的SH相連，也可以是2個、4個Fe離子通過與無機S原子及半胱氨酸殘基的SH連接，形成Fe₂S₂、Fe₄S₄。Fe-S通過Fe²⁺↔Fe³⁺+e^-的可逆反應，每次傳遞一個電子，因此鐵硫蛋白是單電子傳遞體。
細胞色素(cytochrome, Cyt)是一類含血紅素樣輔基的蛋白質。各種還原型Cyt均有3個特徵性的α、β、γ可見光吸收峰，根據其吸光度和最大吸收波長不同，分為Cyt a、Cyt b和Cyt c三類及不同的亞類, 其所含的血紅素輔基分別稱為血紅素a、b和c。Cyt光吸收的差異是由於血紅素中卟啉環的側鏈基團、血紅素在蛋白質中所處環境不同所致。血紅素a的卟啉環側鏈中，1個甲基被甲醯基取代，1個乙烯基連接聚異戊二烯長鏈；血紅素b的結構與血紅蛋白中的血紅素相同。 血紅素a和b都通過非共價鍵與Cyt a和Cyt b蛋白相連。而Cyt c蛋白，其血紅素卟啉環的乙烯基側鏈通過共價鍵與蛋白質中半胱氨酸殘基的—SH相連。細胞色素蛋白通過輔基血紅素中的Fe離子發揮單電子傳遞體的作用。

具有傳遞電子能力的蛋白質複合體組成呼吸鏈

線粒體是真核細胞生成ATP的主要部位。NADH、FADH₂在線粒體中通過逐步、連續的酶促反應被氧化，並逐步釋放能量，除了產生熱能外，釋放的能量主要被ADP捕獲用於生成ATP。催化此連續反應的酶是由多個含輔因子的蛋白質複合體組成，按一定順序排列在線粒體內膜中，形成一個連續傳遞電子／氫的反應鏈，氧分子最終接受電子和H⁺生成水，故稱為電子傳遞鏈(electron transfer chain)。由於此體系需要消耗氧，與需氧細胞的呼吸過程有關，也稱之為呼吸鏈(respiratory chain)。
呼吸鏈主要由位於線粒體內膜上的4種蛋白質複合體(complex)組成，分別稱之為複合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。每個複合體都由多種酶蛋白、金屬離子、輔酶或輔基組成。複合體的輔因子通過得失電子的方式傳遞電子；有些複合體是跨膜蛋白質，可將H⁺從線粒體基質側轉運至細胞質側，形成線粒體內膜兩側H⁺濃度和電荷的梯度差。因此，呼吸鏈在傳遞電子的過程中，伴隨着H⁺的跨膜轉運，下面將分別敘述各複合體的組成、輔因子、結構特點以及功能。

複合體Ⅰ將 NADH 中的電子傳遞給泛醌

複合體Ⅰ又稱 NADH-Q 還原酶或 NADH 脫氫酶，是呼吸鏈的主要入口，其功能是接受來自 NADH 的電子並轉移給Q。 複合體Ⅰ是由黃素蛋白、鐵硫蛋白等組成的跨膜蛋白質，呈「L」型，其長臂的一端突出於線粒體基質中，包括黃素蛋白（含 FMN 和 Fe-S 輔基）、鐵硫蛋白（含 Fe-S 輔基），可結合基質中的NADH；嵌於內膜的橫臂為複合體的疏水部分，含 Fe-S 輔基。黃素蛋白和鐵硫蛋白均通過輔基發揮傳遞電子作用。
複合體Ⅰ傳遞電子的過程：黃素蛋白輔基 FMN 從基質中接受NADH 中的2H⁺和2e^-生成 FMNH₂ ,經過一系列的 Fe-S 將電子傳遞給內膜中的 Q, 形成 QH₂, 即：NADH→FMN→Fe-S→Q。由於Q在線粒體內膜中可自由移動，在各複合體間募集並穿梭傳遞氫，因此在電子傳遞和質子的移動中發揮核心作用。
複合體Ⅰ還具有質子泵功能：將一對電子從 NADH 傳遞給 Q 的過程中，能將 4 個H⁺從線粒體的基質側(negative side, N 側）泵到膜間隙側(pos山ve side, P 側），泵出質子所需的能量來自電子傳遞過程。

複合體Ⅱ將電子從琥珀酸傳遞到泛醌

複合體Ⅱ是琥珀酸－泛醌還原酶，即三羧酸循環中的琥珀酸脫氫酶，其功能是將電子從琥珀酸傳遞給Q。人複合體Ⅱ通過其疏水亞基錨定於線粒體內膜，而伸向基質的亞基含有結合底物琥珀酸的位點，以及 Fe-S 和 FAD 輔基。
複合體Ⅱ傳遞電子的過程：催化底物琥珀酸的脫氫反應，使 FAD 轉變為 FADH₂ ,後者再將電子經Fe-S 傳遞到 Q。即：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。此過程釋放的自由能較小，不足以將H⁺泵出線粒體內膜，因此複合體Ⅱ沒有H⁺泵的功能。代謝途徑中另外一些含 FAD 的脫氫酶，如脂醯 CoA 脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、膽鹼脫氫酶等，通過不同的方式將相應底物脫下的氫經 FAD 傳遞給 Q,進入呼吸鏈。

複合體Ⅲ將電子從還原型泛醌傳遞至細胞色素c

複合體Ⅲ又稱泛醌－細胞色素c還原酶，其功能是接受QH₂的電子並傳遞給 Cyt C。Q從複合體Ⅰ、複合體Ⅱ募集氫，產生的QH₂穿梭至複合體Ⅲ，後者將電子傳遞給Cyt c蛋白。
人複合體Ⅲ由Cyt b(b₅₆₂ ，b₅₆₆)、Cyt c₁和鐵硫蛋白組成二聚體，呈梨形。其中Cyt c₁和鐵硫蛋白的疏水區段將複合體錨定在線粒體內膜。複合體Ⅲ有2個Q 結合位點，分別處於膜間隙側（Q_p）和基質側（Q_N）位點。
複合體Ⅲ傳遞電子的過程：由於Q 是雙電子傳遞體，而Cyt c是單電子載體，所以複合體Ⅲ將電子從QH₂傳遞給Cyt c的過程是通過「Q循環」(Q cycle)實現的。簡單而言，QH₂結合在Q_P位點，分別將2e^-經Fe-S 傳遞給Cyt c₁和結合在Q_N位點的Q。此過程重複一次後，Q_P位點的QH₂將2e^-經Cyt c₁傳遞給2分子Cyt c, 重新釋放Q 到內膜中，而Q_N位點的Q接受2e^-和基質的2H⁺被還原為QH₂。因此每2分子QH₂經過Q循環，生成1分子Q 和1分子QH₂, 將2e^-經Cyt c₁傳遞給2分子Cyt c。即：QH₂→Cyt b→Fe-S→Cyt c₁→Cyt c。另外， 複合體Ⅲ還具有質子泵的功能，每傳遞2e^-向膜間隙釋放4H⁺。
Cyt c是呼吸鏈中唯一的水溶性球狀蛋白質，與線粒體內膜的外表面疏鬆結合，不包含在上述複合體中。Cyt c從複合體Ⅲ中的Cyt c₁獲得電子傳遞到複合體Ⅳ。

複合體Ⅳ將電子從細胞色素c傳遞給氧

複合體Ⅳ又稱細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase), 是電子傳遞鏈的出口，其功能是接受還原型Cyt c的電子並傳遞給O₂生成H₂O。複合體Ⅳ也有質子泵功能，每傳遞2e^-將2個H⁺泵至膜間隙側。
人複合體Ⅳ包含13個亞基，亞基1～3構成複合體Ⅳ的核心結構，含Fe、Cu離子結合位點，發揮電子傳遞作用。亞基2的半胱氨酸-SH可結合2個Cu離子，每個Cu離子都可傳遞電子，形成一個雙核中心(binuclear center)的功能單元，稱Cu_A中心，其結構類似Fe₂S₂。Cu_A中心與Cyt a蛋白中血紅素的Fe極為接近(1.5nm), 電子可由Cu_A中心傳遞到Cyt a。而亞基l含血紅素a和a₃，在血紅素a₃鄰近處結合1個Cu離子，稱Cu_B, 因此血紅素a₃中的Fe離子和Cu_B形成第二個雙核中心，即血紅素a₃-Cu₈(Fe-Cu)中心。雙核中心是複合體Ⅳ發揮電子傳遞的功能單元。
複合體Ⅳ傳遞電子的過程：還原型Cyt c蛋白提供的電子經Cu_A中心傳遞到Cyt a, 再到Fe-Cu中心。需要依次傳遞4個電子，並從線粒體基質獲得4個H⁺，最終將1分子O₂還原為2分子H₂O。其過程為：Cyt a傳遞第一個、第二個電子到氧化態的Cyt a₃-Cu_B雙核中心(Cu²⁺和Fe³⁺), 使Cu²⁺和Fe³⁺被還原為Cu⁺和Fe²⁺,並結合O₂分子，形成過氧橋連接的Cu_B和Cyt a₃, 相當於2e^-傳遞至結合的O₂。 中心再獲得2個H⁺和第三個電子，O₂分子鍵斷開，Cyt a₃出現Fe⁴⁺中間態。再接受第四個電子，Fe⁴⁺還原為Fe³⁺並形成Cu_B²⁺和Fe³⁺各結合1個OH基團的中間態。 最後再獲得2個H⁺，雙核中心解離出2個H₂O分子後恢復初始的氧化態。即：Cyt c→CuA→Cyt a一Cyt a₃-CuB→O₂。生成的H₂O通過亞基l和3之間的親水通道排入胞質側。
上述O₂在獲得電子過程產生的具有強氧化性的O_2·^-和O₂^2-離子中間物始終和雙核中心緊密結合，通常不會對細胞組分造成損傷。

NADH和FADH₂是呼吸鏈的電子供體

營養物質的分解代謝中，大部分脫氫酶以NAD⁺，NADP⁺，FMN或者FAD為輔酶或輔基，用來接受從底物上脫下來的成對氫，生成還原態的NADH+H⁺ ,NADPH+H⁺ ,FMNH₂和FADH₂, 它們都是水溶性的電子載體。由於呼吸鏈的複合體Ⅰ即為NADH脫氫酶，可使線粒體中的NADH通過呼吸鏈徹底氧化參與能量代謝。雖然NADPH通過相同的機制傳遞氫，但所含的磷酸基團可被生物合成過程中的酶特異性識別，主要用於還原反應，而非參與能量代謝。複合體Ⅱ是三羧酸循環中的琥珀酸脫氫酶，通過結合底物琥珀酸並將其脫氫氧化，產生的FADH₂直接進入呼吸鏈進行氧化釋能。因此NADH和FADH₂是呼吸鏈的電子供體，而FMN 和FAD 作為黃素蛋白的輔基參與電子傳遞。
呼吸鏈由NADH 和FADH₂提供氫，通過4個蛋白質複合體、Q, 以及介於複合體Ⅲ與Ⅳ之間的Cyt c 共同完成電子的傳遞。複合體Ⅱ並不是處於複合體Ⅰ的下游，複合體Ⅰ和複合體Ⅱ分別獲取各自的氫，向Q傳遞。因此4個複合體與Q和Cyt c 組成了兩條電子傳遞鏈。一條稱為NADH呼吸鏈，以NADH為電子供體，從NADH開始到還原O₂ 生成H₂O。電子傳遞順序是：
NADH→複合體Ⅰ→Q→複合體Ⅲ→Cyt c→複合體Ⅳ→O₂
另一條稱為FADH₂呼吸鏈，也稱琥珀酸氧化呼吸鏈，以FADH₂ 為電子供體，經複合體Ⅱ到O₂ 而生 成H₂O。電子傳遞順序是：
琥珀酸→複合體Ⅱ→Q→複合體Ⅲ→Cyt c→複合體Ⅳ→O₂
呼吸鏈各組分的排列順序是由下列實驗確定的：

• 根據呼吸鏈各組分的標準氧化還原電位進行排序。標準氧化還原電位E°(單位：電壓Volts)是指在特定條件下，參與氧化還原反應的組分對電子的親和力大小。電位高的組分對電子的親和力強，易接受電子。相反，電位低的組分傾向於給出電子。因此，呼吸鏈中電子應從電位低的組分向電位高的組分進行傳遞。
• 底物存在時，利用呼吸鏈特異的抑制劑阻斷某一組分的電子傳遞，在阻斷部位以前的組分處於還原狀態，後面的組分處於氧化狀態。根據各組分的氧化和還原狀態吸收光譜的改變分析其排列次序。
• 利用呼吸鏈各組分特有的吸收光譜，以離體線粒體無氧時處於還原狀態作為對照，緩慢給氧，觀察各組分被氧化的順序。
• 在體外將呼吸鏈拆開和重組，鑑定四種複合體的組成與排列。