生物化學與分子生物學/基因治療

基因診斷和基因治療 - 基因診斷 - 基因治療
基因治療是以改變人遺傳物質為基礎的生物醫學治療，即通過一定方式將人正常基因或有治療作用的DNA片段導入人體靶細胞以矯正或置換致病基因的治療方法。它針對的是疾病的根源，即異常的基因本身。在此過程中，目的基因被導入靶細胞內，它們或與宿主細胞染色體整合成為宿主細胞遺傳物質的一部分，或不與宿主細胞的染色體整合而獨立於染色體以外，但都可以在宿主細胞內表達 基因產物蛋白質，而達到治療作用。目前基因治療的概念也有了較大擴展，凡是採用分子生物學技術和原理，在核酸水平上展開的對疾病的治療都可納入基因治療範圍。基因治療的範圍也從過去的單 基因遺傳病擴展到惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經系統疾病、代謝性疾病等。根據治療的靶細胞不同，基因治療可分為生殖細胞(germ -line)治療和體細胞(somatic cell)治療兩大類，由於生殖細胞基因治療涉及倫理及遺傳等諸多問題，目前人類基因治療研究與應用的重點是體細胞治療。

基因治療的基本策略主要圍繞致病基因

基因治療是指將目的基因導入靶細胞，使之成為宿主細胞遺傳物質的一部分，目的基因的表達產 物對疾病起到治療的作用。絕大部分疾病的發生都受到遺傳因素的影響，如果用正常的健康基因替代有缺陷的基因來治療疾病，則為這些疾病的病人提供了一個全新的治療模式。隨着基因治療研究 的不斷深入，不僅可以將外源性正常基因導入病變細胞，產生正常的基因表達產物來補充缺失或功能異常的蛋白質；還可以採用適當的技術抑制過表達基因；亦可以將特定基因導入非病變細胞，在體內表達特定產物；或者向腫瘤細胞等功能異常的細胞中導入該細胞本來不存在的基因，利用這些基因的 表達產物來治療疾病。根據不同疾病的發病機制，所採用的基因治療方式也有所不同，基因治療的基 本策略主要有以下幾種：

缺陷基因精確的原位修復是基因治療的理想方法

包括對致病基因的突變鹼基進行糾正的基因矯正(gene correction)和用正常基因通過重組原位替換致病基因的基因置換(gene replacement)。這兩種方法均屬於對缺陷基因精確的原位修復，既不破壞整個基因組的結構，又可達到治療疾病的目的，是最為理想的治療方法，但目前尚未能從理論和技術上得到突破。

基因增補是目前臨床上使用的主要基因治療策略

不刪除突變的致病基因，而在基因組的某一位點額外插入正常基因，在體內表達出功能正常的蛋白質，達到治療疾病的目的。這種對基因進行異位替代的方法稱為基因添加(gene augmentation)或稱基因增補，是目前臨床上使用的主要基因治療策略。基因增補不僅可以用於替代突變基因，也可以在原有基因表達水平不足以滿足機體需要的情況下，異位過表達來增強體內某些功能。例如在血友病病入體內導入凝血因子Ⅸ基因，恢復其疑血功能；將編碼干擾素和白介素-2等分子的基因導入惡性腫瘤病人體內，可以激活體內免疫細胞的活力，作為抗腫瘤治療中的輔助治療，也稱為基因免疫治療。
由於目前尚無法做到基因在基因組中的準確定位插入，因此增補基因的整合位置是隨機的。這種整合可能會導致基因組正常調節結構的改變，甚至可能導致新的疾病。2004年，法國一兒童醫院接受基因治療的17名嚴重聯合免疫缺陷症病入中，有3人因逆轉錄病毒載體插入並激活LMO-2 基因而罹患白血病。

基因治療可採用基因沉默或失活

有些疾病是由於某一或某些基因的過度表達引起的，向病人體內導入有抑制基因表達作用的核酸，如反義RNA、核酶、干擾小RNA等，可降解相應的mRNA或抑制其翻譯，阻斷致病基因的異常表達，從而達到治療疾病的目的。這一策略稱為基因失活(gene inactivation) 或基因沉默(gene silencing), 也稱為基因干預(gene interference)。需要抑制的靶基因往往是過度表達的癌基因或者是病毒複製周期中的關鍵基因。

自殺基因亦可應用於基因治療

上述三種基因治療的策略都是以恢復細胞正常功能或干預細胞的功能為目的。在腫瘤的治療中，通過導入基因誘發細胞「自殺」死亡也是一種重要的策略。自殺基因治療腫瘤的原理是將編碼某些特殊酶類的基因導入腫瘤細胞，其編碼的酶能夠使無毒或低毒的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導細胞產生「自殺」效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。自殺基因的另一個策略是利用腫瘤細胞特異性啟動子序列（如肝癌的甲胎蛋白啟動子序列）以激活抑癌基因、毒蛋白基因等 「細胞毒性基因」，通過這些特殊的外源基因在腫瘤細胞中的特異性表達以達到對腫瘤細胞的殺傷作用。

基因治療的基本程序

基因治療的基本過程可分為5個步驟：①選擇治療基因；②選擇攜帶治療基因的載體；③選擇基因治療的靶細胞；④在細胞和整體水平導入治療基因；⑤治療基因表達的檢測。

選擇治療基因是基因治療的關鍵

細胞內的基因在理論上均可作為基因治療的選擇目標。許多分泌性蛋白質如生長因子、多肽類激素、細胞因子、可溶性受體（人工構建的去除膜結合特徵的受體），以及非分泌性蛋白質如受體、酶、轉錄因子的正常基因都可作為治療基因。簡言之，只要清楚引起某種疾病的突變基因是什麼，就可用其對應的正常基因或經改造的基因作為治療基因。

治療基因的載體可攜帶基因進入靶細胞

大分子DNA不能主動進入細胞，即使進入也將被細胞內的核酸酶水解。因此選定治療基因後，需要適當的基因工程載體將治療基因導入細胞內並表達。目前所使用的基因治療 用載體有病毒載體和非病毒載體兩大類，基因治療的臨床實施一般多選用病毒載體。
野生型病毒必須經過改造，以確保其在人體內的安全後才能作為基因治療的載體。野生型病毒基因組的編碼區主要為衣殼蛋白、酶和調控蛋白編碼，而非編碼區中則含有病毒進行複製和包裝等功能所必需的順式作用元件。基因治療所用病毒載體的改造是剔除其複製必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。原有的病毒複製和包裝等功能改由包裝細胞(packaging cell)提供。包裝細胞 是經過特殊改造的細胞，已經轉染和整合了病毒複製和包裝所需要的輔助病毒基因組，可以完成病毒的複製和包裝。在實際應用中，治療用病毒載體需要先導入體外培養的包裝細胞，在其中進行複製並包裝成新的病毒顆粒，獲得足撮的重組病毒後再用於基因治療。
目前用作基因轉移載體的病毒有逆轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒（adenovirus）、腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)、單純疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)等。不同類型的病毒載體在應用中具有不同的優勢和缺點，可依據基因轉移和表達的不同要求加以選擇。以下僅以最為常用的逆轉錄病毒和腺病毒載體為例予以說明。
1、逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒屬於RNA病毒，其基因組中有編碼逆轉錄酶和整合酶(integrase)的基因。在感染細胞內，病毒基因組RNA被逆轉錄成雙鏈DNA,然後隨機整合在宿主細胞的 染色體DNA上，因此可長期存在於宿主細胞基因組中，這是逆轉錄病毒作為載體區別於其他病毒載體的最主要優勢。將逆轉錄病毒複製所需要的基因除去，代之以治療基因，即可構建成重組的逆轉錄病毒載體。在目前的基因治療中，70%以上應用的是逆轉錄病毒載體。
逆轉錄病毒載體有基因轉移效率高、細胞宿主範圍較廣泛、DNA整合效率高等優點。缺點主要是在兩個方面存在安全性問題，一是病人體內萬一有逆轉錄病毒感染，又在體內注射了大劑量假病毒後，就會重組產生有感染性病毒的可能；二是增加了腫瘤發生機會。後者的原因是由於逆轉錄病毒在靶細胞基因組上的隨機整合所致，這種整合可能激活原癌基因或者破壞抑癌基因的正常表達。
2、腺病毒載體 腺病毒是一種沒有包膜的大分子雙鏈DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮細胞的感染。人的腺病毒共包含50多個血清型，其中C亞類的2型和5型腺病毒(Ad2和Ad5)在人體內為非致病病毒，適合作為基因治療用載體。
腺病毒載體不會整合到染色體基因組，因此不會引起病人染色體結構的破壞，安全性高；而且對DNA包被量大、基因轉染效率高，此外對靜止或慢分裂細胞都具有感染作用，故可用細胞範圍廣。腺病毒載體的缺點是基因組較大，載體構建過程較複雜；由於治療基因不整合到染色體基因組，故易隨着細胞分裂或死亡而丟失，不能長期表達。此外，該病毒的免疫原性較強，注射到機體後很快會被機體的免疫系統排斥。

選擇基因治療的靶細胞通常是體細胞

基因治療所採用的靶細胞通常是體細胞(somatic cell), 包括病變組織細胞或正常的免疫功能細胞。由於人類生殖生物學極其複雜，主要機制尚未闡明，因此基因治療的原則是僅限於患病的個體，一代，為此國際上嚴格限制用人生殖細胞(germ line cell) 進行基因治療實驗。適合作為而不能涉及下靶細胞應具有如下特點：①靶細胞要易於從人體內獲取，生命周期較長，以延長基因治療的效應；②應易於在體外培養及易受外源性遺傳物質轉化；③離體細胞經轉染和培養後回植體內易成活；④選擇的靶細胞最好具有組織特異性，或治療基因在某種組織細胞中表達後能夠以分泌小泡等形式進入靶細胞。
人類的體細胞有 200 多種，目前還不能對大多數體細胞進行體外培養，因此能用於基因治療的體 細胞十分有限。目前能成功用於基因治療的靶細胞主要有造血幹細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、肌細胞和腫瘤細胞等。

1. 造血幹細胞 造血幹細胞 (hematopoietic stem cell, HSC)是骨髓中具有高度自我更新能力的細胞，能進一步分化為其他血細胞，並能保待基因組DNA的穩定。HSC已成為基因治療最有前途的靶細胞之一。由於造血幹細胞在骨髓中含量很低，難以獲得足夠的數量用於基因治療。人臍帶血細胞是造血幹細胞的豐富來源，其在體外增殖能力強，移植後抗宿主反應發生率低，是替代骨髓造血干細 胞的理想靶細胞。目前已有躋帶血基因治療的成功病例。
2. 淋巴細胞 淋巴細胞參與機體的免疫反應，有較長的壽命及容易從血液中分離和回輸，且對目前常用的基因轉移方法都有一定的敏感性，適合作為基因治療的靶細胞。目前，已將一些細胞因子、功能蛋白的編碼基因導入外周血淋巴細胞並獲得穩定高效的表達，應用於黑色素瘤、免疫缺陷性疾病、血液系統單基因遺傳病的基因治療。
3. 皮膚成纖維細胞 皮膚成纖維細胞具有易採集、可在體外擴增培養、易於移植等優點，是基因治療有發展前途的靶細胞。逆轉錄病毒載體能高效感染原代培養的成纖維細胞，將它再移植回受體動物時，治療基因可以穩定表達一段時間，並通過血液循環將表達的蛋白質送到其他組織。
4. 肌細胞 肌細胞有特殊的T管系統與細胞外直接相通，利於注射的質體DNA經內吞作用進入。而且肌細胞內的溶酶體和DNA酶含量很低，環狀質體在胞質中存在而不整合入基因組DNA, 能在肌細胞內較長時間保留，因此骨骼肌細胞是基因治療的很好靶細胞。將裸露的質體DNA注射入肌組織，重組在質體上的基因可表達幾個月甚至1年之久。
5. 腫瘤細胞 腫瘤細胞是腫瘤基因治療中極為重要的靶細胞。由於腫瘤細胞分裂旺盛，對大多數的基因轉移方法都比較敏感，可進行高效的外源性基因轉移。因此，無論採用哪一種基因治療方案，腫瘤細胞都是首選的靶細胞。

此外，也可研究採用骨髓基質細胞、角質細胞、膠質細胞、心肌細胞及脾細胞作為靶細胞，但由於受到取材及導入外源基因困難等因素影響，還僅限於實驗研究。

將治療基因導入人體有生物學和非生物學法

目前臨床基因治療實施方案中，體內基因遞送(gene delivery)的方式有兩種。一種是間接體內療法(ex vivo) , 即先將需要接受基因的靶細胞從體內取出，在體外培養，將攜帶有治療基因的載 體導入細胞內，篩選出接受了治療基因的細胞，繁殖擴大後再回輸體內，使治療基因在體內表達相應產物。其基本過程類似於自體組織細胞移植。另一種是直接體內療法(in vivo) , 即將外源基因直接注入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞並進行表達。
基因導入細胞的方法有生物學和非生物學法兩類。生物學方法指的是病毒載體所介導的基因導入，是通過病毒感染細胞實現的，其特點是基因轉移效率高，但安全問題需要重視。非生物學法是用 物理或化學法，將治療基因表達載體導入細胞內或直接導入人體內，操作簡單、安全，但是轉移效率低。

治療基因表達的檢測方法較多

無論以何種方法導入基因，都需要檢測這些基因是否能被正確表達。被導入基因的表達狀態可以用PCR、RNA印跡、蛋白印跡及ELISA等方法去檢測。對於導入基因是否整合到基因組以及整合的部位，可以用核酸雜交技術進行分析。

基因治療的醫學應用

基因治療作為一門新興學科，在很短的時間內就從實驗室過渡到臨床，已被批准的基因治療方案有兩百種以上，包括腫瘤、愛滋病、遺傳病和其他疾病等。在中國，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血友病Ⅸ因子、抑癌基因TP53 等基因治療的臨床方案已進入市場或臨床試驗。
遺傳病的基本特徵是由遺傳基因改變所引起的。只受一對等位基因影響而發生的疾病屬於單基因遺傳病，設計基因治療方案相對容易，例如鐮狀細胞貧血、α-地中海貧血、血友病等。高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病的發生是多個基因相互作用的結果，並受環境因素影響，基因治療的效果還有待於基礎研究的突破。

1. 單基因遺傳病的基因治療 單基因缺陷引起的遺傳病，由於其致病基因比較清楚，所以基因治療方案也相對容易確定。基本方案是通過一定的方法把正常的基因導入到病人體內，表達出正常的功能蛋白。例如將人Ⅸ因子基因與逆轉錄病毒載體重組後轉移到血友病病人自體的皮膚成纖維細胞中，使病入血中Ⅸ因子濃度升高，出血症狀及出血次數都明顯減少。
2. 針對多基因病的基因治療 基因治療最早是針對一些單基因遺傳病進行的，但是隨着人類對其他疾病分子機制的深入了解、對許多疾病相關基因的分離和功能的研究，人們逐漸將基因治療的策略用於如惡性腫瘤、心血管疾病、糖尿病及愛滋病等，尤其是對惡性腫瘤的基因治療寄予極大的希望。目前已被克隆的惡性腫瘤相關基因很多，動物模型比較成熟，病人及親屬易接受，所以，惡性腫瘤的基因治療研究日趨活躍，並取得了顯著的成果。到目前為止世界各國已經批准開展進行的基因治療方案中，70%以上是針對惡性腫瘤的。

惡性腫瘤的基因治療包括：針對癌基因表達的各種基因沉默、針對抑癌基因的基因增補、針對腫瘤免疫反應的細胞因子基因導入和針對腫瘤血管生成的基因失活等。
其他的基因治療方案包括：利用過表達VEGF基因促進血管生成治療冠心病、針對病毒複製基因的基因沉默治療愛滋病等。

基因治療的前景與問題

經過20多年的努力，科學家們在基因治療領域取得了很大的進步，獲得了一些成功，但是仍然存在一些亟待解決的間題。這些問題包括：①缺乏高效、靶向性的基因轉移系統；②對於多種疾病的相關基因認識有限，因而缺乏切實有效的治療靶基因；③對真核生物基因表達調控機制理解有限，因此對治療基因的表達還無法做到精確調控，也無法保證其安全性；④缺乏準確的療效評價。目前的基因治療臨床試驗中，限於倫理問題，多選擇常規治療失敗或晚期腫瘤病入，尚難以客觀地評價治療效果。
將基因治療方案用於人體必須經過嚴格的審批程序，需要專門機構的審批與監督。在中國，任何基因治療方案都要經國家食品藥品監督管理局審批。1999年6月頒佈的《人基因治療申報臨床試驗指導原則》詳細規定了基因治療所用生物製劑的研製、生產工藝、製劑的質量控制、臨床實驗和臨床療效評價的各個環節中應該遵守的原則。所有基因治療的臨床使用必須嚴格遵守這些法律法規。
近年來中國對基因診斷與基因治療領域非常重視，雖然沒有新出台專門的規範性文件法規，但在國家大的規劃方面均有涉及。在《「十三五」衛生與健康規劃》（國發(2016]77號）中提出在加強行業規範的基礎上，推動基因檢測、細胞治療等新技術的發展。在《「十三五」國家戰略性新興產業發展規劃》（國發(2016)67號）中提出發展專業化診療機構，培育符合規範的液體活檢、基因診斷等新型技術診療服務機構。推動基因檢測和診斷等新興技術在各領域應用轉化。建立具有自主知識產權的基因編輯技術體系，開發針對重大遺傳性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤等的基因治療新技術。在《「十三五」國家科技創新規劃》（國發[2016]43號）中提出開展重大疫苗、抗體研製、免疫治療、基因治療、細胞治療、幹細胞與再生醫學、人體微生物組解析及調控等關鍵技術研究，研發一批創新醫藥生物製品，構建具有國際競爭力的醫藥生物技術產業體系。在《中國防治慢性病中長期規劃(2017—2025年》（國辦發[2017]12號）提出支持基因檢測等新技術、新產品在慢性病防治領域推廣應用。