生物化學與分子生物學/其他實驗技術/熒光原位雜交實驗（FISH）

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用於動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。

實驗方法原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用於動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照鹼基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由於DNA分子在染色體上是沿着染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。

雜交所用的探針大致可以分類三類：

1）染色體特異重複序列探針，例如α衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大於1Mb，不含散在重複序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，易於檢測；
2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質體中的染色體特異大片段獲得；
3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。

探針的熒光素標記可以採用直接和間接標記的方法。間接標記是採用生物素標記DNA探針，雜交之後用藕聯有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素複合物，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由於不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。

實驗材料、試劑、儀器耗材：

人的MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本

指甲油、甲醯胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20等

恆溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等

實驗步驟：

實驗材料準備

1. 實驗用具及材料

2. 相關溶液的配製

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調pH 至7.0）。

（2）去離子甲醯胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲醯胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

（3）體積分數70%甲醯胺/2×SSC：35 mL甲醯胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

（4）體積分數50%甲醯胺/2×SSC：100 mL甲醯胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

（5）體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

（6）雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

（7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩衝液配製該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20℃保存備用。

（8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配製1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

（9）封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

（10）封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

實驗方法及步驟

探針變性

將探針在75℃恆溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈DNA探針變性。

標本變性

（1）將製備好的染色體玻片標本於50℃培養箱中烤片2～3 h。（經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色後再烤片）。

（2）取出玻片標本，將其浸在70～75℃的體積分數70% 甲醯胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序將標本經體積分數70%、體積分數90%和體積分數100%冰乙醇系列脫水，每次5 min，然後空氣乾燥。

雜交

將已變性或預退火的DNA探針10 μL 滴於已變性並脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置於潮濕暗盒中37℃雜交過夜（約15～17 h）。由於雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。

洗脫

此步驟有助於除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

（1）雜交次日，將標本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標本放置於已預熱42～50℃的體積分數50%甲醯胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。

（3）在已預熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。

（4）在室溫下，將玻片標本於2×SSC中輕洗一下。

（5）取出玻片，自然乾燥。

（6）取200 μL復染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

雜交信號的放大（適用於使用生物素標記的探針）

（1）在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2）去掉保鮮膜，再加150 μLavidin-FITC於標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續溫育40 min。

（3）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。

（4）在玻片標本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。

（5）去掉保鮮膜，加150 μLantiavidin於標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。

（6）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。

（7）重複步驟（1）、（2）、（3），再於2×SSC中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然乾燥。

（9）取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

封片

可採用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

熒光顯微鏡觀察FISH結果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然後打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490 nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針所在的位置發出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發光和發射光波長及濾光鏡選擇。