生物化學與分子生物學/其他實驗技術/畢氏酵母(Pichia pastoris)感受態細胞製備及轉化

畢氏酵母氯化鋰轉化法

試劑

1M LiCl（用去離子蒸餾水配製，濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋）

50% PEG3350（Sigma P3640  用去離子蒸餾水配製，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝）

2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

註：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；

感受態畢氏酵母的製備

接種Pachia pastoris到50ml YPD培養基中，30℃搖菌過夜（約24～28h）培養到OD值為0.8～1.0（約108 Cells/ml）；

收穫細胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min；

重懸細胞於1ml 100mM LiCl溶液中，將懸液轉入1.5ml離心管；

離心機最大速度離心15秒沉澱菌體，重懸菌體於400ul 100mM LiCl溶液中；

按50ul/管分裝，立即進行轉化；

註：不要將感受態酵母菌冰浴；

畢氏酵母的轉化

煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以製備單鏈擔體DNA；

將感受態酵母菌離心，以Tips去除殘餘的LiCl溶液；

對於每一個轉化，按以下順序加入：

50% PEG3350	240ul
1M LiCl	36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA	25ul
5～10ug/50ul H2O 質體DNA	50ul

   

劇烈旋渦混勻直至沉澱菌體完全分佈均勻（約1min）；

30℃水浴孵育30min；

42℃水浴熱休克20～25min;

6000～8000rpm離心收集酵母菌體；

重懸酵母於1ml YPD培養基，30℃搖床孵育；

1～4h後，取25～100ul菌液鋪選擇性培養基平板，於30℃培養2～3天鑑定；

畢氏酵母PEG1000轉化法

試劑

緩衝液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol

緩衝液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35

緩衝液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35

未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存

註：

• 緩衝液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;
• 將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處（即使在冰上解凍的待轉化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進行多樣品的轉化，建議按6樣品/組進行）;

待轉化畢氏酵母的製備

接種環接種Pachia pastoris於YPD平板，30℃培養2d;

挑取單克隆酵母菌株於10mlYPD培養基中，30℃振盪培養過夜；

取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養基中振盪培養，待其OD值從0.1升到0.5～0.8；

室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩衝液A洗滌一次；

重懸菌體於4ml緩衝液A中，按0.2ml/管分裝於1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合後迅速於液氮中冷凍，

-70℃保存

畢氏酵母的轉化

將約50ug線性化質體DNA溶於20ul TE或水中，直接加於凍結的酵母細胞中；加入擔體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得最大轉化率；

37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次；

取出離心管，加入1.5ml緩衝液B，徹底混勻；

30℃水浴孵育1h；

室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉澱重懸於1.5ml緩衝液C中；

離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸於0.2ml緩衝液C中；

將所有轉化液鋪於選擇性平板，於30℃孵育3～4天後，鑑定；

畢氏酵母電轉化法

E.coli TOP10F』感受態細胞的製備

取10ul TOP10F』菌液，接種於200ml LB液體培養基中活化培養，37℃，200 rpm，16～18小時。取100ul菌液接種於200ml液體LB培養基中。

37℃，200 rpm，培養16～18小時。

滅菌500 ml離心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌體沉澱。棄上清，菌體用10％甘油重懸並洗滌。重複洗滌3次。

第三次離心後，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用於重懸菌體。

從製得得感受態細胞中，取200ul於滅菌EP管中，加入連接反應產物5ul，混勻，不要產生氣泡，在冰上放置5min。

將混勻後得200ul菌液移入電擊杯中。

使用電擊穿孔儀進行轉化，設置為電壓 2500 V，時間 5 ms。

電擊後，往電擊杯中加入 800ul SOC培養基，沖洗出菌體，轉移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。

取全部均勻塗佈於含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待塗布液不在流動，37℃ 培養12～16小時。

線性化質體DNA對Pichia pastorisGS115的轉化

取新鮮製備的（或－70℃凍存的）感受態細胞置於冰浴中，使其完全解凍；

1. 將100μl菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中，加入5－20μg線性化質體（5～10μl），輕彈混勻，盡數吸出轉移到0.2cm 型的電穿孔轉化杯中；
2. 轉化杯置於冰浴中5～10分鐘，保持低溫。
3. 電穿孔轉化電擊條件：電壓：1500V；電阻：400Ω；電容：25μF；脈衝時間：10mS；一次電擊。
4. 電擊後，馬上在電擊轉化杯中加入1ml 4℃預冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置於冰浴中；
5. 取30℃烘至表面半乾的MD培養基平板，在超淨工作枱上無菌操作塗布平板，400μl/板

畢赤酵母電轉化方法

菌體的準備

1. 挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養過夜；
2. 取100-500μl的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250-300r/min培養過夜，至OD600達到1.3~1.5；
3. 將細胞培養物於4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸；
4. 按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸；
5. 按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸；
6. 按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸，其終體積約為1.5ml；
7. 備註：可將其分裝為80μl一份的包裝冷凍起來，但會影響其轉化效率（2周之內）。

電擊轉化

1. 將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中；
2. 將電轉化杯冰浴5min；
3. 根據電轉化儀提供的資料，參考其他文獻及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數，按優化的參數，進行電擊；
4. 電擊完畢後，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5ml的EP管中；
5. 將菌體懸液塗佈於MD或RDB平板上，每200~600μl塗布一塊平板；
6. 將平板置於30℃培養，直至單個菌落出現。

推薦：電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時間為4～10msec