細胞生物學/Transwell實驗方法

Transwell實驗方法

這裡想明確兩個概念，一個是Transwell，另一個是腫瘤細胞侵襲模型。

關於Transwell這個詞該如何解釋，查了很多資料也未見準確的註解，我覺得可以這麼理解吧，trans-這個詞根有轉移、轉運、穿過等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據Corning公司的Transwell說明書中的介紹，可以認為這是一種膜濾器（Membrane filters），也可認為是一種有通透性的支架（permeable supports）。

更準確地說，Transwell應該是一種實驗技術，這項技術的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對Transwell會有不同的命名，而不同型號也可有不同形狀，不同大小，根據實驗需要，可有不同選擇。

但無論是何種外形，其關鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其餘部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1－12.0µm，根據不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。

將細胞種在上室內，由於聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

下面參考guxuefeng戰友和cosmosci戰友的帖子具體來談談孔徑的選擇，當然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。這裡主要談幾種大家常用的實驗：

（1）共培養體系：

小於3.0um孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應選擇3.0µm以下孔徑。常用 0.4、3.0µm。我們實驗室用的是0.4µm。

將細胞A種於上室，細胞B種於下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的影響。

（2）趨化性實驗

可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。

①細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種於上室，細胞B種於下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的趨化作用。

②趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種於上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。

（3）腫瘤細胞遷移實驗

常用8.0、12.0µm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

（4）腫瘤細胞侵襲實驗

常用8.0、12.0µm膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。

上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側鋪上一層基質膠，用以模仿體內細胞外基質，細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

腫瘤細胞侵襲模型

用於研究腫瘤細胞侵襲能力的腫瘤細胞侵襲模型有如下幾種（引自司徒鎮強《細胞培養》）：

2.1 體內癌細胞侵襲模型

2.1.1 皮下移植侵襲模型

2.1.2 肌肉內移植侵襲模型

2.1.3 腹腔內移植侵襲模型

2.1.4 小鼠腎包膜下移植侵襲模型

2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵襲模型

2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵襲模型

2.1.7 鼠爪墊皮下移植侵襲模型

2.1.8 視網內界膜侵襲模型

2.2 體外癌細胞侵襲模型

2.2.1 體外靜止器官培養法

2.2.1.1 半固體培養基單細胞器官培養法

2.2.1.2 液體培養基單細胞器官培養法

2.2.2 半體外半體內器官培養法

2.2.3 單層細胞器官培養法

2.2.4 瘤細胞球體器官培養法

2.2.4.1 靜止球體器官培養法

2.2.4.2 旋轉搖動球體器官培養法

2.2.5 單層細胞侵襲實驗模型

2.2.6 Transwell侵襲小室測定法

可見，Transwell與侵襲實驗之間並不能劃等號，Transwell有多種應用，侵襲實驗也有多種方法。所謂Transwell侵襲實驗，其實是指將Transwell這一技術應用於腫瘤細胞侵襲研究的一種實驗。由於其簡單易行、重複性好，因而得到了越來越廣泛的應用，但不能認為研究腫瘤侵襲只有Transwell一種方法。

Transwell侵襲實驗

我的課題涉及Transwell侵襲實驗和Transwell遷移實驗，其他方面的Transwell應用我不太清楚，因此這裡主要談談 Transwell侵襲實驗。

1.實驗用品

① Transwell小室：

多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產的小室，我們實驗室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有 Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰友介紹的Thincert。

這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴，我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經鋪好膠的，質量很好，但是非常貴，24孔板配套的小室，每個價格約130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價格不清楚。Coster和Corning公司生產的小室，是論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據說每個小室成本只有40左右，應該比較適合中國國情。

下面是一些戰友提供的價格，具體建議大家聯繫代理商諮詢。linanping1979戰友提供的價格：coster的24孔板的transwell 的價格是456元RMB,8µm，用於腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰友提供的價格：Millipore的8µm的50個1760RMB,0.4µm的 2000多,是一次性的。梅林戰友提供的BD價格： 240RMB一塊（6.5um,24孔,12instert），好像是沒膠的。liguofan說國產的boyden30塊一個。jjyy提供的價格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民幣不到。平均每個20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過其實洗洗泡泡還是可以重複用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完後擦去基質膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很乾淨，用前用紫外里外都照30min。sword01戰友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3×5min，蒸餾水3×5min，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h，微波，低火 10min×2。

因為我買的是鋪好膠的，所以沒買Matrigel，二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的Chemicon ECM550系列，膜很結實，擦不壞，可以反覆用很多次，但現在的膜已經改用一種很薄很脆的材料，一般只能重複用一次，真黑啊！很多戰友說Costar和 Corning也是可以重複用的，大家可以試試。

本人沒見過，有興趣的可以自己研究一下。

另外，根據論壇戰友提供的信息，osmonic公司有專用的膜出售，鼎國生物代理。Transwell小室用過後，可把原來的膜切下，貼上 osmonic公司的膜，這樣又可以用了，不過我沒用過，有興趣的可以試試。maojianwen戰友的使用方法： trasnwell小室做一次後，將原來的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然後用女士用指甲油（注意用無色較稀的）將osmonic公司的膜貼上，剪掉多餘的邊緣。再照紫外。

② 上層培養液：

上層培養液採用無血清培養基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。

③ 細胞：

值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用於Transwell侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數百，多則數千，並不是筆小數目，還是小心為妙。

另外，為了讓實驗結果更明顯，可先撤血清讓細胞飢餓12－24h，再進行實驗。

④ 基質膠：

常用的是人工重構基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，生產廠家有BD、美國Collaborative Rsearch公司等。CaoY戰友的帖這麼說的：Matrigel是BD公司生產的，是一種細胞外基質，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在sigma叫ECM。zhangyong1036戰友提供的價格：BD公司的matrigel 1500左右。

如果購買的小室是已經鋪好基質膠的，那麼Matrigel就不需要購買了。

⑤ 下層培養液：

下層常用含5%－10% FBS的培養基，具體濃度根據細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰友將纖維粘連蛋白加入下層培養液作為趨化因子，但個人認為，FBS仍是最合適的。

⑥ 細胞培養板：

常用於Transwell侵襲實驗的細胞培養板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。細胞培養板沒什麼特殊要求，普通的細胞培養板就可以。但要注意，細胞培養板應當與購買的Transwell小室相配套。

⑦ 此外，膜的下室面可塗上纖維粘連蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附着在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。很多戰友認為這不是必須的，而且我也是不塗的，細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。 linanping1979戰友認為，如果培養時間很長（>24h），細胞還是會掉到下室裡面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層塗上FN。

另外，值得一提的是，膜下層塗上FN還有一定的趨化作用。

2．步驟

2.1 Transwell小室製備

2.1.1 無基質膠Transwell小室製備

① 包被基底膜：

用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風乾。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻塗抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了塗在膜上。

② 水化基底膜：

吸出培養板中殘餘液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma戰友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋後的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。

2.1.2 有基質膠的Transwell小室製備

Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養板中，在上室加入300µl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15－30min，使基質膠再水化。再吸去剩餘培養液。

2.2 製備細胞懸液

① 製備細胞懸液前可先讓細胞撤血清飢餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步並不是必須的。

② 消化細胞，終止消化後離心棄去培養液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至1－10×105，個人認為不要超過 5×105。

具體實驗時採用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最後用計數法統計結果的話將難以計數；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。

個人認為，對照組和處理儘量不要分開計數，因為細胞數目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數，那麼計數一定要多重複幾次，力求準確，儘量保證對照組和處理組細胞密度一致。

2.3 接種細胞

① 取細胞懸液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200µl。

② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趨化因子的培養基，不同的培養板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這裡要特別注意的是，下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。

③ 培養細胞：常規培養12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內對細胞增殖並無明顯抑制，但24h後，抑制作用就開始出現了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必須限定在24h 內，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數目少於對照組，那麼就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由於侵襲被抑制引起，還是處理後細胞數目本身就比對照組少而引起的了。

時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內會有一定量的MMPs儲存，短時間內可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發揮作用，影響MMPs表達，到最後釋放到培養基中，還需要一個過程。時間點的選擇可儘量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應，但前提是這個時間範圍內細胞數目不能有明顯變化。

另外，我看到細胞在小室內的形態不是正常培養貼壁的形態，而是圓形的，仍是懸浮時的形態，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現象

在培養過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產生，這是正常現象，可不予處理，但我遇到過培養一段時間後，膜下出現了大氣泡，幸虧及時發現，否則後果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞後1－2h把培養板從培養箱裡拿出來看看，確信沒有大氣泡產生。

2.4 結果統計

檢測穿過的細胞數有兩種方法：

2.4.1 直接計數法

2.4.1.1 「貼壁」細胞計數

這裡所謂的「貼壁」是指細胞穿過膜後，可以附着在膜的下室側而不會掉到下室裡面去。如下圖：

通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞

① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞

② 染色：常用的染色方法有結晶紫染色、台肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。

個人推薦採用0.1%結晶紫染色，這種方法有如下優勢：(1). 不需要固定細胞，直接染色即可。(2). 配製簡單方便。(3). 染色後可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm 測其OD值，間接反映細胞數。個人認為這是結晶紫染色最大的優勢所在。因為，雖然經過準確的細胞計數，往往穿過膜的細胞數仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數了，這種情況下就可以用醋酸脫色後用酶標儀檢測。使用結晶紫染色要注意，染色前要將膜風乾，否則可能會染不上。

③ 細胞計數：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附着的細胞。也有不少人用手術刀將膜切下後染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。

取若干個視野計數細胞個數。論壇里一般採用3－5個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的 ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。

如圖，藍色部分表示膜的大小，白色圓形表示視野的大小，綠色方形則表示拍照時所能拍下的視野的中心部分。這樣，每個小室都拍攝如下圖的16個視野進行計數，這樣得到結果是比較客觀和準確的。

2.4.1.2 「非貼壁」細胞計數

由於某些細胞自身的原因或某些膜的關係，有時細胞在穿過膜後不能附着在膜上，而是掉進下室。如下圖：

                                                                

2.4.2 間接計數法

間接計數法主要用於穿過細胞過多，而無法通過計數獲得準確的細胞數所採用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。

2.4.2.1 MTT法

① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞

② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培養基，將小室置於其中，使膜浸沒在培養基中，37℃ 4h後取出。

③ 24孔板中加入500µl DMSO，將小室置於其中，使膜浸沒在DMSO中，振盪10min，使甲臢充分溶解。取出小室，24孔板於酶標儀上測OD值。

2.4.2.2 熒光試劑檢測

這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon 的ECM554即屬於這類。

2.4.2.3 結晶紫檢測

上文已說過，這裡不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結晶紫染色還有個優點，就是染色和脫色的過程並不影響膜上細胞，在脫色後還可重新染色。

這是用正置顯微鏡拍攝的圖，結晶紫染色，進行細胞計數。

Transwell的其他應用的實驗步驟

Transwell腫瘤細胞遷移實驗

過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認為，由於沒有基質膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×105，而遷移實驗的密度是1×106。另外，下層培養液的FBS濃度也可適當下調，我做侵襲實驗的濃度是5%，遷移實驗的濃度是2.5%。

cathywxy戰友的Transwell上皮細胞培養步驟

做了一段時間的原代細胞培養，把經驗拿出來跟大家分享一下吧，請有關戰友共同探討：

(1) 將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置於4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青黴素和100ug/ml鏈黴素（Gibco-BRL）、無Ca 2＋、Mg2＋，無血清的MEM。

(2) 用無菌的細胞刮棒刮氣管內壁，將所得溶液離心後得到游離細胞。

(3) 離心後立即用新鮮的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青黴素和100 ug/ml 鏈黴素的LHC-8 medium (Biofluids)沖洗一次。

(4) 沖洗過後，將得到的細胞懸液用台盼蘭測定活力，若存活率大於90％，則將細胞以106/cm2密度接種於可通透的多聚碳濾膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空氣含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青黴素and 100ug/ml 鏈黴素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5) 孵育後，經測定跨上皮電阻在1000~2000Ω之間，即可用於電生理試驗。

顯微鏡下氣管上皮細胞形細胞呈鋪路石狀，圓形核位於中央，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片

metastasis戰友的Transwell B16細胞的體外遷移實驗

我以前用 costar的Transwell做過B16細胞的體外遷移實驗，具體是這麼做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面塗一層fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小時，PBS洗一遍後，放入預先每孔加有600ul的培養基（含10%血清）的24孔板內，後在Transwell的內室加入細胞（100ul,用含0.1%血清的培養基稀釋好自己所需密度），放入培養箱，12-18小時後，取出Transwell，用棉簽擦去PVPF膜靠近內室那一面的細胞，另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘，結晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，後在顯微鏡下觀察細胞，記數。

mci戰友的內皮細胞HMEC-1遷移實驗

1%明膠處理的transwell經無血清的MCDB131培液於培養箱中平衡1小時後，上室加入100µl用serum-free MCDB131稀釋的5*104/孔的HMEC及不同濃度的藥物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移,同時設置相應陰性及陽性對照，置於CO2培養箱中作用8小時，然後棄去孔中培液，用 90%酒精常溫固定30分鐘，0.1%結晶紫常溫染色10分鐘，清水漂淨，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，顯微鏡(Olympus, DP50, Japan).下觀察並拍照，最後用10%乙酸100µl/孔抽提10分鐘，於600nm處測定OD值。抑制率計算公式為：抑制率（%）=[(OD值給藥組-OD值無刺激陰性對照)/（OD值不加藥陽性對照- OD值無刺激陰性對照)] ×100%.