細胞生物學/胚胎幹細胞

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在個體發育的袋胚階段，其囊胚腔中的內細胞團細胞具有多向分化潛能，它可以分化為胎兒或成體組織中的各種細胞類型。若採用實驗的手段，將內細胞團細胞分離出來，並將其在體外穩定培養，所得到的這種細胞就是一般所說是的胚胎幹細胞(ES細胞）。胚胎幹細胞的另一個來源是原腸胚之後的原始性腺中分離獲得的，也被稱為EG細胞(embryonic germ cell) , 與ES細胞具有相似的性質。

胚胎幹細胞的生物學特性

胚胎幹細胞為未分化多能性細胞，它可表達早期胚胎細胞的分子標記，但在不同的物種之間，其表面抗原的表達情況可有很大的差異，例如，小鼠的胚胎幹細胞可以表達階段特異性胚胎抗原-1(SSEA-1)、不表達SSEA-3和SSEA-4,但人的胚胎幹細胞則不表達SSEA-1, 而表達SSEA-3和SSEA-4。此外，分離自內細胞團發育階段之後的早期胚胎中的具有多向分化潛能的EG細胞(embryonic germ cell), 由於細胞所處的發育階段不同，其分子標誌與胚胎幹細胞也是不完全一致的。例如，人EG細胞可表達SSEA-1,但人胚胎幹細胞則不表達SSEA-1。

胚胎幹細胞體外培養中呈現克隆化生長和快速增殖的特性

胚胎幹細胞具有原始細胞的形態和生化特徵。胚胎幹細胞的體積較小，核質比例較大，內質網及高爾基複合體等細胞器不發達。在囊胚中，它們以緻密的集落樣的形式（即內細胞團）生長，並附着於囊胚的內側壁。在體外培養的條件下，胚胎幹細胞的體積仍然很小，核質比例很大，核中可有多個核仁，它們也是以緻密的集落樣的形式生長，形似鳥巢。胚胎幹細胞可以在體外無限擴增，增殖迅速，可以進行傳代、遺傳操作和凍存，表現並保持穩定的、正常的二倍體核型。現在已經知道，各種哺乳動物的胚胎幹細胞在體外培養條件下都具有相似的形態特徵。

胚胎幹細胞具有向三個胚層分化的潛能

在個體發育中，存在於瘓胚內細胞團中的千細胞具有分化為後續發育個體的任何組織細胞的潛能。由於胚胎幹細胞體外培養的成功，這一概念已經通過實驗的方法得到了充分的證實。其大致的做法有三個方面：①將培養的胚胎幹細胞在體外條件下進行誘導分化，然後觀察其分化的情況。例如，將人胚胎幹細胞在沒有胎鼠成纖維細胞作為飼養層的條件下進行培養，其胚胎幹細胞就會發生分化，而且在其培養液中還可以檢測到α-甲胎蛋白和人絨毛膜促性腺激素(hCG)的存在，這表明有向內胚層和滋養層方向分化的現象發生。又如，將胚胎生殖細胞置於白血病抑制因子存在的條件下，其中的部分細胞能分化成胚狀體(embroyoid body, 曾稱類胚體、擬胚體）。在所形成的類胚體中，可以發現有屬於三個胚層的各種類型的分化細胞的存在，這就說明了胚胎生殖細胞具有多能性幹細胞的特性。②將體外培養的胚胎幹細胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮下，然後觀察是否可以形成混合組織瘤。例如，將人胚胎幹細胞移植到重症聯合免疫缺陷小鼠的皮下，其移植細胞就可以產生胚胎組織瘤，而且在其瘤組織中觀察到了胃上皮（內胚層），骨和軟骨組織、平滑肌和橫紋肌（中胚層），神經表皮、神經節及復層鱗狀上皮（外胚層）等細胞的存在，這就提示了人胚胎幹細胞具有形成內、中、外三個胚層的潛能。③「嵌合體」實驗。將體外培養的胚胎幹細胞移植到小鼠娛胚腔中，觀察植入的細胞是否可以分化為各組織細胞。1990年，A. Nagy等通過顯微注射的方法，將體外培養的小鼠胚胎幹細胞植入小鼠的囊胚腔，使其參與內細胞團的繼續發育，進而通過對所發育小鼠的各種組織的分析，發現組成這些組織的細胞有些來源千植入毅胚腔的外源ES細胞，故稱該小鼠為「嵌合體小鼠＂。該實驗證明了胚胎幹細胞確實具有分化為包括生殖細胞在內的各種組織細胞的潛能。這種形成「嵌合體」的實驗被認為是證明ES細胞多分化潛能的「金標準」。然而，由於倫理道德等方面的原因，這種方法不能用於人胚胎幹細胞的分化評價。
目前，隨着研究的深入，ES細胞多能性、自我更新與定向分化機制也被逐漸闡明。當前研究證明，人與小鼠的胚胎幹細胞在諸多方面存在差異，比如兩種胚胎幹細胞所需的培養條件完全不同，細胞所形成克隆的形態、生長、表面標記及潛能狀態均不一樣，但是不論小鼠還是人類，細胞的多能性主要由一個由轉錄因子Oct4為核心，同時包括Sox2與Nanog的多能性網絡調控。儘管該多能性環路在人與小鼠多能幹細胞中相對保守，但多能性因子的下游通路以及相應的精細調控可能並不完全一致。至於這種差別是由種系的不同引起，抑或是由千發育時程的不匹配所致，目前還沒有確切的結論。

胚胎幹細胞的體外分化

一般認為，ESC的分化受到內源性和外源性因素的共同調節。內源性因素即不同基因在不同時間和空間的開啟和關閉，涉及各種轉錄因子的作用。外源性因素則是指細胞間的分化誘導、分化抑制作用及細胞外物質的介導作用。
ESC的分化研究分為一般誘導分化和定向誘導分化兩類。前者是指加入一定的分化誘導劑，常用的是全反式維甲酸(RA) ,ESC就可以同時或先後分化出不同類型的細胞，這反映了ESC不受約束的自我分化，應用意義不大。目前主要目標是針對不同的終末目標細胞，通過改進培養方式、選擇分化誘導劑，研究ESC的定向分化。目前已報道的由ES細胞誘導分化的細胞主要有造血細胞、心肌細胞、神經細胞、脂肪細胞、胰島細胞、內皮細胞、上皮細胞、肝細胞、成骨細胞和軟骨細胞、胰島素分泌細胞等等。
目前的研究方法大約分成兩大類，一種方法是胚狀體的誘導分化。先誘導胚胎幹細胞形成胚狀體，然後再從胚狀體中分離所需要的目標細胞，進而擴大培養獲得一定數量的目標細胞。胚狀體通常由具有三個胚層特性的衍生物所組成，可以認為是大多數成熟體細胞系的前體細胞。中胚層和外胚層的前體細胞在幾天內便可形成，而一些內胚層的細胞類型則需要較長的時間，一般在10天以後。第二種方法是不經過胚狀體，而是利用單層培養的ES細胞，直接誘導獲得目標細胞，當然這種誘導往往要經過分步誘導才能完成。

將ESC誘導分化為中胚層細胞

胚狀體形成之後，可將其調整為一般的正置狀態進行培養，使其附着於培養皿的表面上生長，這時有可能在胚狀體上觀察到個別正在發生「搏動」的區域。在隨後的正置貼壁培養中，可以看到大片狀的、呈同步收縮的細胞。在具有收縮特性的細胞群中，反映心臟不同特殊功能的細胞可以用電生理方法檢測出來，包括心房樣細胞、心室樣細胞、浦肯野細胞樣細胞和結細胞樣細胞。研究發現，將胚胎於細胞來源的心肌細胞植入小鼠體內之後，這些胚胎幹細胞來源的心肌細胞能夠整合入小鼠心臟組織中，並參與血管形成，而且還能在所植入的位置上繼續增殖與分化。目前，已經可以基於鼠胚胎幹細胞誘導分化的方案，從人類胚胎幹細胞中產生心肌細胞，這無疑為再生醫學中的心臟組織工程提供了一個全新的思路。但是，該方案也存在一些問題。例如，除了組織免疫相容性的問題之外，胚胎幹細胞來源的心肌細胞的分化狀態也正在得到關注，這些在體外狀態下所得到的分化細胞更多地表現為胎兒心肌細胞的特徵，而沒有成人心肌細胞的基本表型。也有研究發現，植入的具有自主「搏動」特性的心肌細胞還可能會引發嚴重的心律失常，這些細胞一旦整合入內源性的心臟組織中，這種心律失常則很難加以糾正。因此，胚胎幹細胞的治療在從實驗室研究到臨床應用之前，還有許多問題需要解決，其中最為重要的一點就是要證實，由胚胎幹細胞分化產生的各種類型的分化細胞是否具有與宿主組織之間發生完全的功能性整合的能力。

將ESC細胞誘導分化為外胚層細胞

依據發育生物學的基本理論，現已在體外建立起了一套化學成分確定的人類多能幹細胞向神經定向分化的誘導系統，能較好地模擬了人類神經發育早期的主要過程，且時間區分明顯，各時期的標記物清楚，是研究人類神經發育的良好模型。例如，由ES細胞形成的胚狀體在不加額外的誘導因子的清況下，細胞在第7天開始表達轉錄因子Pax6(Paired box protein 6)。如果生長於培養皿面上，這些早期的神經上皮細胞於一周後形成明顯的花環狀結構，並開始表達其他神經系的標記物如Soxl。激活FGF信號通路，或抑制SMAD通路，會明顯促神經分化。細胞表達Pax6但尚未表達Soxl時，它們能在塑型因子的作用被定向分化至特定細胞譜系。例如，在視黃酸RA作用下，本來向顱側分化的細胞轉而向脊髓分化。但是，RA能對細胞起作用的時間窗口往往非常短暫，只有幾天時間，一旦細胞開始表達Soxl, 這些細胞便不能再被分化為脊髓細胞。
小鼠胚胎幹細胞向神經外胚層的分化相對容易，目前已有幾種不同的方案來得到大量的神經元樣、星形膠質細胞樣或少突膠質細胞樣細胞。這些方案可以不必經過胚狀體的步驟，而是直接通過胚胎幹細胞的單細胞層培養的方式，使其分化為神經外胚層細胞。這種分化方案可以將超過80%的人多能幹細胞轉變為PAX6⁺神經系細胞，進而能分化為各種細胞亞類。有研究表明，這些分化細胞被植入小鼠模型後，仍然具有功能活性（即可以形成突觸並產生動作電位），而且能夠整合入大腦，並可糾正某些神經變性疾病的表型。

將ESC細胞誘導分化為內胚層細胞

由於在胚胎發育過程中，內胚層的出現最晚，所以其細胞特化過程較為複雜，所以ES細胞的體外誘導分化獲得內胚層細胞，理論上也更困難一些。關於胚胎幹細胞向肺泡上皮細胞的分化，雖然目前也有一些工作，但由於肺的細胞組成和組織結構複雜性以及對肺前體細胞缺乏確切的定義，以及誘導效率較低而且純化困難而始終無法得到廣泛推廣。
目前也有通過先將ES細胞誘導成內胚層來源的前體細胞然後再進一步誘導成肺、肝、胰腺等組織細胞。隨着胚胎發育的分子機制研究的深入，控制分化的關鍵基因逐漸清晰，通過優化體外誘導體系獲得內胚層細胞也是比較可行的路線。
儘管目前在實驗室里確實可以將胚胎幹細胞誘導分化為許多類型的具有相應表型的細胞，但在其分化的效率、成熟的程度、分離的純度以及在活體中是否具有真正的功能等方面則仍然還有許多問題需要解決。

誘導性多潛能幹細胞的獲得及生物學特性

2006年，日本科學家山中伸彌團隊成功地利用病毒載體轉染將四個轉錄因子Klf4、Sox2、Oct4及c-Myc導入小鼠成纖維細胞獲得了多潛能細胞，僅僅一年後，人的多潛能細胞也通過相同的轉錄因子體系或不含有c-Myc的轉錄因子體系而成功建立，這些重編程的多潛能細胞現在被稱為誘導性多潛能幹細胞(induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)。 雖然這些人iPS細胞的多潛能性質與人ES細胞並不完全一致，但是他們的確在形態和分化能力上面與人ES細胞極其相似，比如在體外能分化成三胚層而且能在免疫缺陷小夙體內形成畸胎瘤。
人們最初對iPS的興趣主要集中在iPS細胞在藥物篩選、模擬人類疾病和病人個體化治療方面的潛在應用前景上。最初的誘導體系使用了逆轉錄或慢病毒載體基因轉導體系來構建iPS細胞，其潛在的不利後果是轉基因可隨機插入到基因組中，可能會破壞正常基因表達，所以後來很多實驗室的工作集中在如何避免使用病毒和不引起插入突變方面。最近出現的方法中有利用非整合型質粒載體和可移除的轉座子進行基因轉染的，有通過直接導入轉錄因子雷組蛋白的方法進行重編程的。比較有臨床應用價值的是利用某些小分子化合物來誘導細胞重編程為iPS細胞的方法。通過高通扯藥物篩選可以獲得這些有效小分子的最佳組合，這種方法由於誘導成分明確而且沒有外源基因的導入，安全性會更高。
雖然目前還沒有利用iPS治療疾病的臨床前和臨床實驗報道，但是由於其來自於病人自身，使用中不會產生免疫排斥反應，使得iPS細胞在某些疾病治療方面顯示出ES細胞所沒有的優越性。對某些遺傳缺陷的病人，可以將他們的iPS細胞進行基因打靶或者基因編輯技術對基因缺陷進行修復，然後再移植到病人體內，達到恢復正常基因功能的目的，這種設想在小鼠鎖刀型貧血症的治療中已經取得成功。基因修正的iPS細胞來源的肺前體細胞也同樣被證明在治療遺傳突變引起的肺病，像囊性纖維化、αl-抗胰蛋白酶缺乏，和表面活性蛋白不足等疾病治療中具有很好的效果。