細胞生物學/細胞工程的主要相關技術

細胞工程 - 細胞工程的主要相關技術 - 細胞工程的應用
細胞工程涉及面很寬，所用技術方法也很多，但就總體來說，細胞工程可以認為是不同層次上的細胞拆合與重組工程。這些層次是細胞整體層次，如細胞培養、細胞融合、細胞重編程；細胞器層次，如核移植；以及分子層次，如基因轉移等。

大規模細胞培養

所謂大規模細胞培養(large scale cell culture)是指細胞的高密度(density)或高濃度(concentration)培養，培養容量在2L以上，需要藉助細胞培養容器，目的是製備大量的細胞或是以此來生產更多的細胞產物。一般說來，1×l0⁹～1×10¹⁰個細胞可以在1～10L容積的簡單攪拌瓶培養獲得。但1×10¹¹～1×10¹²個細胞的更大規模培養則需要一系列設備如生物反應器，培養規模可以是100L實驗室規模，100～1000L中試規模，5000～20000L產業化規模。
目前，大規模細胞培養的方法很多，大致可分為懸浮細胞培養和貼壁細胞培養兩大體系。但在實際應用中，常分為懸浮培養、固定化培養和微載體培養三種方法。

懸浮培養

細胞在培養液中呈懸浮狀態生長和增殖的培養方法稱懸浮培養(suspension culture)。懸浮培養適用於血液淋巴組織細胞及其腫瘤細胞（小鼠骨髓瘤細胞SP2/0、NSO)、轉化細胞(Namalwa細胞）、融合細胞（雜交瘤細胞）的培養。隨着規模化培養技術的不斷發展，許多貼壁生長細胞如CHO細胞經懸浮馴化後也可進行懸浮培養。懸浮培養多用於大量生產抗體、疫苗和細胞因子等重組蛋白類藥物。
懸浮培養的優點是設備相對比較簡單而容積可選擇性大，培養容積最大可以達25 OOOL。這種方式培養可連續收集培養細胞或其產物進行分析，也可適時地傳代，操作和控制簡便。還有一個優點是傳代時無需消化，細胞不會因胰酶和EDTA(乙二胺四乙酸，elhylenediamine lelra acetic acid)的處理以及激烈的機械力分散而受損傷，而且細胞回收率高。再者，由於細胞呈懸浮生長，而且處於不斷攪動的動態生長過程之中，細胞的濃度（細胞數/ml)均一，因此可在線直接監測細胞生長情況，工藝可控性強，細胞的濃度可以得到及時有效的調控，細胞的產量比較恆定。
懸浮培養的技術關鍵在於不斷攪拌培養液以及連續通氣供給CO₂和空氣，以便使細胞均勻有效地進行營養物質和氣體交換，同時不致產生細胞沉降。總體而言，營養物質和氧氣的傳遞效率較好，培養條件均一。懸浮培養條件下，滲透壓、剪切力、氣泡破裂均可引起細胞損傷。非離子表面活性劑Pluronic家族可有效保護細胞免受攪拌和通氣反應器中的流體機械破壞作用。常用保護性添加劑包括Pluronic F68(0.01%～0.1%, 羧甲基纖維素(1%～2%)等。

固定化培養

使細胞限制或定位於特定空間位擋的培養技術稱之為固定化培養。幾乎所有動物細胞都可採用固定化培養。固定化培養的製備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法和微囊化等，常用吸附法和包埋法兩大方法。
吸附法是最簡單的固定化培養技術，即讓細胞在適當的條件下貼附在載體（如陶瓷顆粒、玻璃珠或硅膠顆粒）表面，或附着於中空纖維膜，或附着於培養容器表面。包埋法是將細胞包埋於多聚物（如蛋白質、碳氫化物等）等海綿狀基質中進行培養的技術。常用蛋白質多聚物有明膠、海藻酸鈣疑膠、膠原和纖維蛋白質等；對於貼壁依賴性細胞通常採用膠原包埋，而對於非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。
最簡單的固定化培養系統是Nunc細胞工廠。該系統由一組長方形的Petri培養板組成，總面積可達600～2400cm²。此外常用的還有中空纖維灌流法、螺旋卷膜培養等。
固定化培養對貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞均適用，其優點在於細胞可維持在較小體積培養液中生長，細胞生長密度可達到很高。如Nunc工廠一次產認可高達3×10⁸～3×l0⁹個細胞。此外，細胞易於產物分開，有利於產物的分離純化。

微載體培養

細胞貼附在一定的固相表而進行單層培養的技術稱為貼壁細胞培養。貼壁培養系統主要有滾瓶中空纖維、微載體等，尤以微載體常見。
微載體培養是讓細胞吸附於微載體(microcarriers)表面或內部進行生長與增殖的細胞培養技術，如Vero細胞的培養。細胞的貼附與細胞表面及微載體表面的化學物理性質有關。微載體表面帶有正電荷而細胞表面帶有負電荷，這種靜電吸引作用使細胞易於貼附於微載體表面。用於製備微載體的材料首先應對細胞沒有毒性作用；其次，應能夠承受高壓滅菌，並可重複利用。微載體是直徑在150～250μm的透明小顆粒，常用的材料有交聯葡聚糖、塑料基質、聚苯乙烯、明膠、玻璃介質、膠原或膠原塗層、纖維素、生物玻璃等。

三維細胞培養

三維細胞培養(three-dimensional cell culture, TDCC)是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞載體複合物。三維培養體系為細胞提供類似體內生長環境，細胞通過緊密連接和（或）縫隙連接等連接方式建立細胞間及細胞與胞外基質間的聯繫，形成一定的三維結構；這種培養方法獲得的細胞在基因表達、基質分泌及細胞功能活動、細胞分化等方面與傳統二維培養的細胞均有明顯差異，與體內細胞生長情況更為相似。三維細胞培養既能保留體內細胞微環境的物質結構基礎，又能體現細胞培養的直觀性及條件可控性；它將單層細胞培養體系與組織器官及整體研究聯繫起來，甚至在一定程度上可以替代動物，進行藥物研發與毒性試驗。

細胞融合

細胞融合(cell fusion), 又稱細胞雜交(cell hybridization)，是指2個或2個以上的細胞合併成1個細胞的過程，所產生的細胞稱雜交細胞(hybrid)。該過程涉及質膜的連接與融合，胞質合併，染色體、細胞器以及各種胞質成分的混合。基因型相同的細胞融合所形成的雜交細胞稱為同核體(homokaryon), 基因型不同的細胞融合所形成的雜交細胞稱為異核體(heterokaryon)。
細胞融合現象最早是由G. Bars如等入於1961年發現，他們將高度惡性與低度惡性腫瘤細胞混合培養，觀察到細胞能自發融合產生雜交細胞。1962年，Y. Okada和J. Tadokoro發現利用紫外線滅活的仙台病毒可以促進細胞的融合。除了滅活的病毒之外，某些化學物質，如聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)、溶血卵磷脂、油酸等以及物理性刺激，如電場、電脈衝等都可以促進細胞的融合。
細胞融合是否成功最為關鍵的技術之一在於對雜交細胞的篩選，即挑選出所需要的雜交細胞。通常有下列三種方法：

1. 抗藥性篩選 常用HAT培養基篩選。HAT是由次黃嘌呤(hypoxanthino, H)、氨基蝶呤( aminopterin, A)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine, T)組成的培養基，其原理是當一種胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(TK^-)細胞與次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷(HGPRr)細胞融合後所得的是一種既含有TK酶又含有HGPRT酶的雜交細胞，只有這兩種基因互補的細胞才具有在HAT選擇培養基中存活下來的能力。
2. 營養缺陷篩選 某些細胞在缺乏某種營養成分的培養基中不能存活，稱之為營養缺陷型細胞，如5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromouridine deoxyribose)缺陷(BUdR^-)細胞。因此可以利用分裂細胞DNA中因摻入有BUdR而對紫外線更敏感的特性，先用光照來殺傷未融合細胞，再將存活下來的缺陷型細胞培養於完全培養基中使其增殖生長。
3. 溫度敏感篩選 正常哺乳動物細胞可在32～40℃環境中存活，最適溫度為37～38℃。利用化學誘變的方法可使細胞發生突變，然後用非允許溫度即38～39℃進行篩選，讓溫度敏感突變型細胞存活下來，這樣的細胞株稱為熱敏感突變株。反之，我們也可用低溫來篩選，所得到的細胞為冷敏感突變株。溫度敏感突變的機制在於溫度依賴性基因的產物只有在一定的溫度下才具有功能， 非此溫度沒有活性。
   

細胞融合技術的不僅為研究細胞的遺傳變異、進化、發育等基礎研究提供了有利的方法，而且它也是細胞工程的重要工具。因為藉此技術，人們可以在種內、種間、甚至動植物間進行細胞融合，產生新的品種，甚至物種，更可以藉此生產單克隆抗體這樣的生物製劑，用於臨床實踐。

細胞核移植

細胞核移植(nuclear transfer)是指通過顯微操作(micromanipulation)將一個細胞的細胞核移植到一個去核的卵母細胞內的技術過程。1938年德國發育生物學家H. Spemann最早提出了進行兩棲類 動物核移植試驗的設想。1953年R. Briggs和T. J. King將一個已分化的細胞核移植入去除卵細胞核的豹蛙(Rana pipiens)卵中，觀察到這種卵仍然可發育至豹蛙幼體。1962年，J.Gurdon將已分化的蝌蚪腸上皮細胞核移植入去除細胞核的非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵中，得到了發育完全正常的成體爪蟾。1963年，中國科學家童第周將金魚的襲胚細胞核植入去核的未受精卵內，首次得到了克隆魚。在細胞核移植方法方面，除了可用顯微操作儀(micromanipulator)外，利用游離的細胞核也可進行, 即用細胞鬆弛素(cytochalasin)處理細胞結合離心方法使細胞脫核，然後經PEG將該細胞核融合進另一完整的細胞中，或者融合入一個胞質體內，這種雜交細胞稱為胞質雜種(cybrid) , 以別於有核間融合所產生的雜交細胞。
在核移植的研究與實踐中，最令人矚目的是克隆羊多利(Dolly)的出生。1997年2月23日，英國Roslin研究所宣布世界第一頭克隆綿羊誕生。該克隆羊的產生過程如下：首先從一個蘇格蘭母羊(A)體內取出卵母細胞，將其核去掉成為無細胞核的卵細胞。再從另一頭芬蘭母羊(B)的乳腺上皮分離得到體細胞，將其細胞核取出，然後讓它與上述去核的卵細胞融合，產生雜交細胞，這種雜交細胞在體外可以發育至囊胚期，然後再將該囊胚（胚泡）植入另一頭蘇格蘭母羊(C)的子宮內，最後生產出小羊。由於該小羊的遺傳特性來源於供核母羊(B)，因此，該小羊是供核母羊的克隆。母羊(A)主要是提供了細胞核發育所需的營養與環境，而母羊(C)只是「代孕」母親。
由於Roslin研究所I. Wilmut在克隆羊多利中所用的是乳腺細胞核，所以該過程稱為體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer)。多利羊的成功在理論上具有重要意義，即證明高度分化的成體體細胞核在成熟卵母細胞中仍然可以被激活並且重新編程(reprogramming)；另外，它還可以發育成為一個完整的個體。因此，這種核仍然具有分化全能性(totipotency), 但是該細胞核-質間的相互作用過程及機制尚未完全闡明。
隨着幹細胞技術和核移植技術的快速發展，科學家成功製備了核移植胚胎干(nuclear-transfered embryonic stem, ntES)細胞。儘管ntES細胞像ES細胞一樣來自痰胚的內細胞團，具有多分化潛能和高增殖特性，可以向任何一種胚層的細胞發育，但是，它與傳統意義上的胚胎幹細胞具有很大的區別。ntES 細胞來自核移植胚胎而不是正常發育的胚胎，ntES的遺傳物質與供體核完全一致，所以，ntES 移植到供核體體內，理論上不會引起免疫排斥反應。此外，就人胚胎幹細胞(hESCs) 建系，還可從三原核人受精卵(tripronuclera human zygote) 獲得二倍體(diploid) 或三倍體(triploid) 的幹細胞，在動物還可從孤雌(parthenogenesis) 激活的卵細胞建立幹細胞系。
除了理論意義外，體細胞核移植技術更是細胞工程領域中的一個極為重大的突破，因為藉此技術人們可以進行同種動物克隆以及異種間的克隆，還可以進行同源克隆(homologous cloning) ,即將一個個體的體細胞核植入同一個體的去核的卵母細胞中，由此獲得的幹細胞植入供核（也供卵母細胞）供體體內不發生免疫排斥。因此，具有極大的細胞治療價值。例如，治療性克隆(therapeutic cloning)是胚胎幹細胞技術與核移植技術相結合，用於產生疾病替代治療細胞的新技術。它以患者的體細胞核為供核，將重構胚培育至囊胚，從內細胞團中分離出ES細胞，為患者提供與其自身遺傳物質一致的組織細胞或器官用於疾病治療，這樣就可以避免異種或同種間細胞/器官移植的免疫排斥反應。該技術使許多目前醫學上沒有有效治療方案的疾病獲得了重新治癒的可能。另一個核移植技術的應用是生殖性克隆(reproductive cloning), 指的是體細胞核移植後，任其發育直至產生一個新個體。多利綿羊即是通過生殖性克隆產生的。生殖性克隆技術應用於人類的實踐即為克隆人。對此，世界多數國家，包括我國政府均堅決反對，但贊同治療性克隆的研究，因為它可以造福多種疾病的廣大患者。

基因轉移

基因轉移(gene transfer)指的是將外源基因導入受體細胞並整合至受體細胞的基因組中，使受體細胞遺傳性狀及表型發生一定改變的技術。藉此過程人們可以選擇出所需的新型細胞，乃至新的個體。若外源基因不但能在動物體內表達，並且可以遺傳，則該動物稱為轉基因動物(transgenic animal)。一般說來該技術包括如下過程：①選擇與提取外源目的基因；②用一定的方法將外源目的基因導入受體細胞；③對整合有目的基因的細胞進行篩選、擴增及鑑定；④若受體為卵細胞，則進行體外培育，並植入合適的動物子宮內；⑤篩選並獲得轉基因動物以及進行後續的所需研究。由上可知，基因轉移是獲得轉基因動物的核心技術。
基因轉移的方法很多，通常可分為：①物理學方法，包括電穿孔法、顯微注射法、裸DNA直接注射法等；②化學方法，包括DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣共沉澱法、脂質體包埋法等；③生物學方法，包括病毒介導法、體細胞核移植法、精子載體法以及胚胎幹細胞轉染法等。下面簡述幾種常用的外源基因導入受體細胞的技術，即細胞轉染(transfection)技術。

磷酸鈣介導的轉染

1973年F. L. Graham等最早採用磷酸鈣將外源基因導入哺乳動物細胞，由於該方法操作簡單，無需昂貴的設備，迄今仍被實驗室廣泛採用。其原理及基本過程是將氯化鈣與外源DNA混合，然後加入到含磷酸根離子的溶液中，即可形成鈣-磷酸-DNA共沉澱物；接着，該沉澱物可被培養的細胞內吞攝取進入細胞質，隨後進入細胞核，DNA整合入細胞基因組中，並最終得到表達。
多種因素可以影響磷酸鈣介導的轉染效率，其中包括細胞的生長狀態（一般以70%匯合為佳）、外源質粒DNA的純度、所形成的磷酸鈣沉澱顆粒的大小以及溶液pH。為了保證DNA的高純度、無內毒素，常通過陰離子交換層析提純或CsCl離心純化DNA。

脂質體介導的轉染

1987年P. L. Felgne1等建立了陽離子脂質體介導的細胞DNA轉染方法，其原理及基本過程是以一種多價陽離子脂質體(lipofectamine)取代單價陽離子載體，當DNA與脂質體通過離子相互作用時，可被直徑為600～1200nm陽離子單層脂質體包被形成複合物，該複合物可與培養細胞的細胞膜融合，使DNA進入細胞並整合至受體細胞的基因組中得以表達。陰離子脂質體也可作為細胞轉染的試劑。
與其他轉染方法相比，陽離子脂質體的主要優點在於轉染成功率較高，70%～80%的離體細胞均可瞬時表達外源基因。該方法用於大片段DNA、RNA、寡聚核苷酸等轉染，具有適應性廣，細胞毒性較低的優點。但脂質體作轉染試劑比較昂貴，不利於大規模使用。

電穿孔法

當把高濃度細胞懸液短暫地暴露於高壓脈衝電流時，DNA可通過高電壓在細胞膜上所形成的可復性小孔進入細胞質內，然後整合入細胞的基因組並得到表達。電穿孔方法可用於對化學法轉染不敏感的細胞。在實踐中，一般選擇恆定的脈衝， 在室溫下進行電穿孔，即在500～1500kV/cm的場強下轟擊細胞；然後將細胞置於冰上，以延長細胞膜孔道的開放時間。一般情況下，經轟擊後能有20%～50%的細胞可以存活下來。
由於貼壁生長的細胞必須附着在培養皿表面才能生長，因此，與貼壁生長的細胞相比，懸浮細胞更適合用電穿孔法進行轉染。另外，該方法所需的細胞及DNA要比化學法更多，而且不同細胞間的最佳轉染參數差異較大，因此常須摸索最適實驗條件。

病毒感染法

這是一種通過病毒感染途徑將外源目的基因導入受體細胞的方法。根據受體細胞的類型不同，可選擇具有不同宿主範圍和不同感染途徑的病毒基因組作為轉染載體。常用的病毒載體包括DNA病毒載體（腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘病毒載體等）和RNA病毒載體（逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等）。用作基因轉染的病毒載體均為複製缺陷型病毒，感染細胞後僅能將基因組整合至細胞，但不能產生包裝的病毒顆粒。在各類病毒載體中，比較常用的是逆轉錄病毒載體和腺病毒載體。
逆轉錄病毒(retrovirus)是一種單鏈RNA病毒，它進入細胞後，在反轉錄酶作用下，RNA反轉錄為DNA, 由於反轉錄病毒的長末端重複序列(LTRs)具有轉錄啟動子的活性，因此將外源DNA連接到LTRs下游可進行重組，再包裝為高滴度的病毒顆粒；轉染方法為病毒直接感染細胞，或者注射病毒至動物體內，攜帶外源基因的反轉錄病毒DNA便可整合入受體的基因組內。誘導多能幹細胞即是利用逆轉錄病毒作為載體將OCT3/4、SOX2、c-myc 和RFI4 導入小鼠成體細胞而獲得的。
腺病毒(adenovirus)為線型雙鏈DNA, 無包膜，其優點是安全性好，不整合入人染色體，不會導致腫瘤發生。此外適用的受體細胞廣，有多種血清型(serotypes)選擇。外源基因在載體上容易高效表達。

顯微注射法

該方法主要用於製備轉基因動物，即在顯微操作儀下，實驗人員通過玻質注射針將DNA迅速注入受精卵內，通常注入雄性原核內或者在其附近，然後將受精卵移植至假孕動物的輸卵管中，最後產生轉基因動物。
該方法需要裝備較昂貴的顯微操作儀, 操作人員必須經過培訓方能操作自如，保證一定的成功率。此外，由於成熟卵母細胞數量少，需用超數排卵(superovulation)技術方能獲得較多的卵以供實驗。

細胞重編程

細胞重編程(cellular reprogramming)是指已分化細胞的核基因組恢復其分化前的功能狀態。該技術是不改變基因序列的情況下，通過表觀遺傳修飾如DNA甲基化來改變細胞的命運，分為多能性重編程和譜系重編程兩大類。利用多能性重編程技術獲得的誘導型多能幹細胞，或譜系重編程技術獲得的組織幹細胞或組織細胞，既具有類似胚胎幹細胞的多能性，又避開了胚胎幹細胞應用的倫理學限制，同時具有患者特異性或疾病特異性，可顯著減少免疫反應，因而極大程度縮短藥物研發進程，並使細胞治療的臨床應用成為可能。

多能性重編程

多能性重編程(pluripotent reprogramming)是指已分化細胞在特定條件下去分化恢復到全能性或多能性狀態，通常可採取核移植、細胞融合、多能細胞提取物共培養以及誘導性重編程等手段實現。其中，誘導性重編程是細胞重編程的一項重大進展，為幹細胞研究領域，乃至整個生命科學領域帶來了概念性的革新。其他重編程技術，如核移植技術涉及倫理問題；而細胞融合方法即將體細胞與胚胎癌細胞、胚胎生殖細胞或者胚胎幹細胞進行細胞融合方法得到的重編程細胞是四倍體，存在很大程度的基因組不穩定；使用多能細胞提取物與體細胞共培養依然需要幹細胞，依然不能克服倫理學問題。
2006年，日本京都大學Yamanaka實驗室利用逆轉錄病毒介導，將4種轉錄因子OCT3/4、SOX2、cmyc 和KFL4 導入小鼠分化細胞中，成功逆轉了分化過程並得到功能上類似胚胎幹細胞的細胞，將其命名為誘導多能千細胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)。iPSC對醫學領域最直接的貢獻在於為疾病研究提供了體外模型。一方面，利用從患者身上建立iPSC疾病模型，可以簡化疾病模型建立過程，用於疾病發病機制研究；另一方面，iPSC可以為新藥開發提供評價模型，用於測試候選藥物的療效、毒性等。2014年，日本進行了世界首例iPSC 應用的臨床研究。科學家將iPSC 分化出的視網膜色素上皮細胞移植到患者體內，用於治療老年性黃斑，這是重編程細胞首次移植到人體內，展示了iPSC在臨床疾病治療方面應用前景。

譜系重編程

譜系重編程(lineage reprogramming)指不經過多能性幹細胞階段，直接將已經分化的成熟細胞（或祖細胞）轉換為另外一種成熟細胞或干/祖細胞的重編程策略，包括轉分化、去分化、轉決定、特定類型的化生等。
轉分化(trans-differentiation)是指直接將一類已分化細胞重編程為另一類已分化細胞，且不經過多能性細胞階段，也稱為譜系轉換。去分化(de-differentiation)是指已分化細胞失去原有的分化結構和功能成為未分化細胞的過程；隨後可將細胞再分化成另一種細胞。誘導性重編程即是最徹底的一個去分化過程。轉決定(trans-determination)是指將一種定向的但尚未完全分化的細胞類型重編程為另一種細胞類型，如成體造血幹細胞、間充質幹細胞的可塑性研究。化生(metaplasia)是指組織中一種分化細胞被另一種分化細胞替代的過程，通常由慢性炎症刺激導致，常見的有鱗狀上皮化生、腸上皮化生、間葉組織化生等。