細胞生物學/流式細胞儀檢測細胞凋亡操作流程

Annexin V 檢測細胞凋亡

實驗原理

Annexin V 是檢測細胞凋亡的靈敏指標之一。它是一種磷脂結合蛋白，可以與早期凋亡細胞的胞膜結合，而細胞質膜的改變是細胞發生凋亡時最早的改變之一。在細胞發生凋亡時，膜磷脂醯絲氨酸(PS)由質膜內側翻向外側。Annexin V 與磷脂醯絲氨酸有高度親和力，因而與細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸結合。由於在發生凋亡時，磷脂醯絲氨酸外翻的發生早於細胞核的改變，因此，與 DNA 碎片檢測比較，使用 Annexin V 可以更早地檢測到凋亡細胞。因為細胞壞死時也會發生磷脂醯絲氨酸外翻，所以 Annexin V 常與鑑定細胞死活的核酸染料(如 PI 或 7-AAD)合併使用，來區分凋亡細胞(Annexin V+/核酸染料-)與死亡細胞(Annexin V+/核酸染料+)。

實驗用品

1. 一次性12×75mm Falcon試管。
2. PBS緩衝液：含0.1%NaN ，過濾後2-8°C保存。
3. 微量加樣器和加樣頭。
4. Annexin V Binding Buffer緩衝液（Cat. No. 66121E）：濃度為10×，使用時，用稀釋為1×濃度的應用液。
5. Annexin V試劑與核酸染料：
   • Annexin V核酸染料
   • Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）
   • Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D）
   • Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）
   • Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）
   • PI（Cat. No. 66211E）或 7-AAD（Cat. No. 34321X）
   • PI（Cat. No. 66211E）
   • 7-AAD（Cat. No. 34321X）
6. FACS流式細胞儀：上樣檢測。
7. CELLQuest軟件：獲取和分析試驗數據。
8. Annexin V檢測對照管：

操作步驟

1. 取 Falcon 試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。
2. 使用冷的PBS緩衝液洗細胞兩次，再用1× Binding Buffer緩衝液製成1×106細胞/ml的懸液。
3. Falcon試管中加入100 µl細胞懸液。
4. 按以下體積加入Annexin V與核酸染料：
5. 輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置15分鐘。
6. *使用Annexin V-Biotin試劑進行檢測時：
   • 1×Binding Buffer緩衝液洗細胞一次，去上清。
   • 1×Binding Buffer緩衝液100µl溶解SAv-FITC試劑0.5µg，加入到細胞管中。
   • 輕輕混勻。
   • 加入5µl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。
7. 各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩衝液400µl。
8. 1小時內上流式細胞儀測定結果。

結果分析

以下 4 個樣本分別是陰性對照、Annexin V 單陽管、PI 單陽管和試驗管。

Annexin V Blocking

待測細胞與未標記的重組 Annexin V 預孵育，然後進行實驗，是 Annexin V 細胞凋亡檢測的質量控制。原理是預先阻斷 Annexin V-FITC 的結合位點，這樣可以證明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特異性。

1. 使用冷的PBS緩衝液洗細胞兩次，再用1×Binding Buffer緩衝液製成1×106細胞/ml的懸液。
2. 在5ml的培養管中加入100µl細胞懸液（約1×10 個細胞）。
3. 加入5-15µg純化的重組Annexin V。注意，不同的細胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達到最好效果，可以減少細胞數量，0.5×10 個細胞加5-15µg純化的重組Annexin V。
4. 輕輕混勻，室溫反應15分鐘。
5. 加入5µl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。
6. 各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩衝液400µl。
7. 1小時內上流式細胞儀測定結果。
8. 結果分析：下圖 A、B 為 Anti-Fas 抗體誘導 3 小時後的 Jurkat T 細胞, 圖 C、D 為未處理的細胞；圖 A、C 為 Annexin V-FITC 染色的凋亡檢測結果，圖 B、D為 Annexin V Blocking 後的檢測結果。

PharMingen Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒

規格:Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I:

Part A：Annexin V-FITC(100 tests)

PI (2ml)

100tests

6693KK

1×Binding Buffer 緩衝液(50ml)

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II (Annexin V

Blocking):

100tests

6710KK

Part A：Annexin V-FITC(100 tests)

PI (2ml)

1×Binding Buffer 緩衝液(50ml)

Part B：Purified Recombinant Annexin V(100µg)

凋亡細胞的 DNA 斷裂片段分析

實驗原理

在細胞發生凋亡後，最早出現胞膜外翻等現象，之後發生的程序性改變之一，就是細胞核酸內切酶激活，出現 DNA 斷裂片段。核酸酶將染色質的高級結構斷裂為 50-300kb 的片段，最終斷裂為 200bp 大小的 DNA 碎片。DNA 碎片檢測的方法是外源性 TdT 酶催化反應，常指「end-labeling」或「TUNEL」 (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。現在可以使用 APO-DIRECT Kit，用流式細胞術來檢測凋亡細胞由於 DNA 斷裂，造成 DNA 鏈 3』-OH 增多的情況。

在 APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化 DNA 單鏈和雙鏈 3』-OH 末端非模板依賴性的 dUTP FITC 摻入反應。由於採用了直接熒光標記的 FITC-dUTP，所以一步反應後，就可以在流式細胞儀上檢測 DNA 碎片。

APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）試劑盒：

Part A（4°C 保存）

PI/RNase A Solution

Reaction Buffer

Rinsing Buffer

Wash Buffer

Part B（-20°C 保存）

FITC-dUTP

TdT Enzyme

Negative Control Cells：已固定細胞

Positive Control Cells：已固定細胞

實驗用品

1. 一次性 12×75mm Falcon 試管
2. 蒸餾水
3. PBS 緩衝液：含 0.1%NaN ，過濾後 2-8°C 保存
4. 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 緩衝液
5. 70%乙醇
6. 冰浴箱
7. 微量加樣器和加樣頭
8. APO-DIRECT Kit 試劑盒
9. 流式上機檢測

操作步驟

1. 細胞固定：

（1） 用PBS 洗細胞後，將細胞重懸於1%多聚甲醛中，濃度為1-2×10 /ml，冰浴30-60 分鐘。

（2） 300×g 離心5 分鐘，棄上清。

（3） 用5ml PBS 洗細胞兩次，重懸於70%乙醇中，濃度為1-2×10 /ml，冰浴30-60分鐘。（70%乙醇細胞懸液在-20°C 放置 12-18 小時後進行細胞凋亡檢測，得到的效果最好。細胞可以在-20°C 保存幾個月。）

2. 配製染色液，現用現配。

DNA 標記液 Reaction Buffer

TdT Enzyme

FITC-dUTP

蒸餾水

3．細胞染色：

（1）取離心管和Falcon 試管，按標本順序編號。

（2）取1×106 細胞懸液加入離心管中，300×g 離心5 分鐘，棄去乙醇，留下沉積細胞。

質控細胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混勻後取1ml（細胞數約1×10 ）加入離心管中，6/ml 300×g 離心5 分鐘，棄去乙醇，留下沉積細胞。

（3） 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗細胞兩遍，棄上清。

（4） 加入染色液50μl，混勻。

（5） 37°C 溫育60 分鐘（或者室溫過夜），每15 分鐘搖勻一次。（非質控細胞 37°C 溫育時間需根據不同情況有所凋整。）

（6） 各管加入1.0ml Rinse Buffer，300×g 離心5 分鐘，棄上清。重複兩遍，棄去上清。

（7） 加入 0.5ml PI/RNase A Solution，混勻。若細胞濃度低，可將用量調整到0.3ml。

（8） 室溫避光處反應30 分鐘。

（9） 3 小時內上流式細胞儀測定結果。

4. 結果分析：PI 測定細胞DNA 含量，FITC-BrdU 測定調亡。

做DNA-W/DNA-A 點圖和DNA-A/FITC-BrdU 點圖，進行數據獲取。取單個細胞門（DNA-W/DNA-A 設門），分析BrdU 直方圖，獲得細胞凋亡信息。同時，可分析細胞周期（DNA-A）與細胞凋亡（BrdU）的關係。

5. 陰性質控細胞 Negative Control Cells 和陽性質控細胞 Positive Control Cells：

BrdU Flow Kits 檢測細胞增殖

實驗原理

BrdU中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養加入，而後利用抗Brdu單克隆抗體，熒光染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。BrdU Flow Kits是用 BrdU染色和流式分析結合高效的試劑盒，包括在BrdU 存在下培養細胞，以適宜濃度的DNA 酶使胞內DNA 變性，加強摻入BrdU 與抗體的親和力，同時保留胞內蛋白結構和熒光素熒光強度，從而避免了DNA 變性條件與胞內及表面標誌同時檢測條件的衝突，運用熒光標記的抗細胞表面抗原單抗及抗細胞因子單抗，結合固定、破膜、通透等處理技術使同時檢測細胞活化、增殖、DNA 合成及胞內細胞因子的分泌成為可能。7-AAD染色總DNA，通過BrdU和7-AAD雙色染色就能刻畫中細胞在整個細胞周期中增殖時期的特點。

BrdU Flow Kits 試劑盒

1. FITC BrdU Flow Kit Cat. No. 559619 (50 tests)
2. APC BrdU Flow Kit Cat. No. 552598 (50 tests)
   • Cat. No. 557891 (4×50 tests)
   • Cat. No. 557892 (4×50 tests)

抗BrdU熒光抗體

每管50μl 染色50 樣本(10 cells/樣本). FITC BrdU Flow Kit(Cat. No. 559619) 包含50μl FITC anti-BrdU抗體。APC BrdU Flow Kit (Cat. No.552598), 包含50 μl APC anti-BrdU抗體。抗體使用前用BD Perm/Wash Buffer按照1:50稀釋。每個樣本加入50 μl 稀釋抗體。

BD Cytofix/Cytoperm™ Buffer

一步法固定透膜試劑用於進行細胞內染色。此試劑維持細胞形態，固定細胞蛋白，為下一步胞內染色進行透膜。

BD Perm/Wash Buffer

10×濃縮液，使用時用去離子水按照1：10稀釋。Perm/Wash Buffer (1×)只能用於固定好的細胞，在未固定的細胞使用該試劑會造成細胞的損傷。

BD Cytoperm™ Plus Buffer

BD Cytoperm Plus Buffer 作為染色增強和二次破膜試劑(100 μl/sample)。只能用於固定好的細胞。

BrdU每個瓶含有0.5ml的10 mg/ml BrdU，稀釋於1×DPBS中的(32.5 mM)溶液。無菌製備所提供的BrdU溶液，(0.22 μm 過濾)其不含有防腐劑；因此推薦在無菌條件下處理該溶液。該母液可以通過腹膜內（i.p.）注射於動物或者稀釋到1 mM溶液用於體外標記。對於通過i.p.注射的體內標記，參見體內標記部分。為了在體外標記細胞，首先通過將31 μl加入到1ml的1×DPBS或者培養基中（這是32×稀釋）將母液(10 mg/ml BrdU溶液)稀釋到1mM溶液。將10 μl的1 mM溶液加入到每ml培養基中以獲得的10 μM最終濃度。BrdU的分子量為307.1。提供5瓶BrdU溶液，並且儲存在–80°C。

注意：已經證實BrdU溶液在4˚C下可以穩定長達4個月或者可以再冷凍。

避免多次冰凍循環。

DNase

每個瓶中含有300 μl的DNase在1×DPBS中的1 mg/ml溶液。當着色10個或更多樣品時，解凍整瓶DNase溶液，加入700 μl的1×DPBS以製備300 μg/ml的工作母液。

注意：如果使用DNase處理少於10個樣品，取30 μl等份的(1 mg/ml)DNase溶液/樣品，並在–80°C下再冷凍剩餘的1 mg/ml DNase。

注意：DNase母液（即，1 mg DNase/ml）在失活前可以再冷凍一次。

使用總計100 μl的工作母液處理每個細胞樣品（即，30 μg DNase/ 10 細胞），在37°C下進行培育。提供5瓶DNase，並且儲存在–80°C。

7-AAD.

每個樣本用20 μl 7-AAD染色 (106 cells/樣本)。

Staining Buffer（未提供）

1×DPBS + 3% 滅活的胎牛血清FBS + 0.09%疊氮化鈉.

Note: BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (Cat. No.554656)

實驗步驟

BrdU體外標記培養的細胞和細胞系

體外標記細胞，每毫升組織培養液中小心加入10 μl BrdU solution (1 mM BrdU in 1×DPBS)這步重要的是避免各種方面對細胞的干擾（例如離心步驟或溫度變化）。這些都可能干擾細胞正常周期。. 細胞培養的密度不要超過2×106 cells/ml 。 孵育足夠的時間。脈衝標記實驗中時間點和脈衝時間長度的選擇依賴於實驗細胞群的細胞周期開始和進展的速度。例如對於活躍增殖細胞系處於對數生長期時(例如, CTLL-2 cells)有效的脈衝時間長度是30-45分鐘。

BrdU Flow Kit 染色步驟

1.染色表面抗原

a. 加入BrdU衝擊後細胞 (10 細胞 / 50μl staining buffer)到流式管

b. 加入含有表面分子抗體staining buffer 50 μl混勻。

c. 冰浴15分鐘。

d. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

2. 用BD Cytofix/Cytoperm Buffer對細胞進行固定和破膜。

a. 用 100 μl BD Cytofix/Cytoperm Buffer重懸細胞。

b. 室溫或冰浴15-30分鐘。

c. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

3. 用 BD Cytoperm Plus Buffer孵育細胞.

a. 用 100 μl BD Cytoperm Plus Buffer重懸細胞

b. 冰浴10分鐘

c. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

4. 再次固定細胞

a. 用 100 μl of BD Cytofix/Cytoperm Buffer重懸細胞

b. 室溫或冰浴5分鐘。

c. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

5. 處理細胞暴露出摻入的BrdU

a. 重懸細胞用100μl稀釋的 DNase (DPBS稀釋成 300 μg/ml )，即每管30 μg DNase。

b. 37°C孵育細胞1小時。

c. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

6. 用熒光抗體染色BrdU和胞內抗原

a. 用 50μl BD Perm/Wash Buffer重懸細胞，其中包含有稀釋的anti-BrdU 和/或胞內特異的抗原的熒光抗體。

b. 室溫孵育細胞20分鐘

c. 加入1 ml staining buffer洗細胞，300×g離心5分鐘，棄上清。

7. 可選項 —染色全部DNA進行細胞周期分析加入 20 μl 7-AAD重懸細胞。

8. 重懸細胞進行流式分析

a. 每管加入1 ml staining buffer 重懸細胞。

b. 流式分析染色樣本 (上樣速度不要超過400個/秒) 。樣本可以4°C過夜。

注意

1. 凍存液: 10%二甲基亞碸DMSO + 90%滅活胎牛血清（FBS）。

2. DNase處理後的細胞儲存在 BD Perm/Wash Buffer過夜，為第二天的染色做準備。

3. 通過識別多聚甲醛固定抗原決定簇，免疫熒光可以同時標記細胞表面和胞內抗原。

4. 如果不用染色總DNA7-AAD步驟可以省略，還可以在FL3進行另一熒光參數的檢測。

流式儀器設置指南

FITC BrdU 儀器設置舉例樣本： FITC anti-BrdU (FL1), 7-AAD (FL3), PE 同型對照(FL2), PE IL-10或PE TNF.

1．調取Lyse/Wash mode條件，調節FSC和SSC電壓到合適位置。

2．染料7-AAD在FL3檢測，改為線性，通過調節FL3電壓，使得G0/G1 期落入50

道上(256 線性分辨率) 或200道 ( 1024 線性分辨率) 。

3．FL1 和FL2對數模式，調整其電壓使未染色組位於陰性位置。

4．補償FITC (FL1) 發射

利用FITC anti-BrdU+ cells管調整補償，調整FL2-FL1，使A2細胞群平行於X軸。

5．補償7-AAD (FL3) 發射

利用7-AAD+ 細胞組調整FL2-FL3的補償，使得FL2中細胞信號都在101以下。

6．利用PE IL-10,FITC BrdU 和7-AAD三色都染後發現圖形中由同型對照設定補償不合適。

7．PE IL-10調整 FL2 – %FL3 (1) andFL3–%FL2(2)補償。使得FL2中細胞群體處於10內。

線粒體膜電位變化檢測細胞凋亡

實驗原理

JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一種廣泛用於檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時 JC-1 為單體(monomer)，可以產生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標誌性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

JC-1 單體的最大激發波長為 514nm，最大發射波長為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為 585nm，最大發射波長為 590nm。

實驗用品

1. 12×75mm 的 Falcon 管和 15ml 聚苯乙烯離心管
2. 微量加樣器和加樣頭
3. 線粒體檢測試劑盒（貨號551302，100tests），包括JC-1和10 × Assay Buffer,註：每個 KIT 包括 4 小瓶 JC-1 試劑，每小瓶試劑足夠檢測 25 個樣本
4. 離心機
5. CO2 培養箱
6. 流式細胞儀

樣本製備

1. 在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根據實驗的量分裝-20度保存。

2. 根據樣本量配製JC-1 Working Solution，每個樣品 500ul 1×Assay Buffer + 5ul JC-1 Stock Solution。工作液應根據樣本量現配現用，多餘的工作液不能儲存後繼續使用。

3. 製備1×10 /ml的細胞懸液， 濃度不宜過高，因為超過該濃度容易造成細胞的凋亡。

4. 誘導細胞進行凋亡的處理，同時保留一份未經誘導的細胞作為對照。

5. 凋亡處理結束後，每個無菌的15ml聚苯乙烯離心管中加入1ml細胞懸液，室溫下，400×g ，離心5分鐘，棄上清。

6. 每管加入0.5 ml 新配的JC-1工作液，充分混勻後置於37°C的CO 培養箱，孵育10-15分鐘。

7. 按以下步驟洗滌細胞兩次：

第一次：每管加體積為 2 ml 的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振盪或用槍頭使細胞分散，以免細胞聚集成塊。400×g ，室溫離心 5 分鐘，棄上清。

第二次：每管加體積為 21ml 的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振盪或用槍頭使細胞分散，以免細胞聚集成塊。400×g ，室溫離心 5 分鐘，棄上清。

8. 每管加體積為0.5 ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，上機檢測。

結果分析

A-C 為對照，細胞亞群(R1)在 FL-2 和 FL-1 通道同時顯示 JC-1 的熒光信號。

D- F 顯示 JC-1 在 FL-2 通道熒光信號降低的細胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細胞發生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關。細胞凋亡時線粒體膜電位發生去極化，JC-1 進入線粒體以單體形式存在，僅在 Fl-1通道有熒光。

注意事項

1. JC-1 避光保存及使用，工作液現配現用，不宜保存後繼續使用。
2. 細胞培養的數量不宜超過 1×10 ，否則細胞會產生自然凋亡影響檢測。
3. 對 PH 變化過於敏感的細胞建議用胎牛血清取代 Buffer 孵育染色及洗滌，或延長觀測時間
4. 流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導劑、細胞株類型，作用時間的不同而熒光強度比例都有不同，因此沒有通用標準的補償設門指南，因此每個試驗需設陰性及陽性對照組進行熒光補償及設門。
5. 組織需先製備單細胞懸液或提取純化線粒體後方可進行檢測。

Active Caspase-3 檢測細胞凋亡

實驗原理

Caspase-3 在早期凋亡細胞中就已經活化，是凋亡程序中的重要的 Caspase酶。凋亡細胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解為一個 17-21kD 亞單位和一個12kD 亞單位，兩個亞單位形成二聚體，即為活化的 Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它 Caspase 酶和多種胞漿內成分（如 D4-GDI，Bcl-2）和核內成分（如 PARP）。

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識別 Caspase-3 活化形式，它特異性識別由無活性的 Pro-Caspase-3 活化水解後的暴露的斷裂端，C92 單克隆抗體與 Pro-Caspase-3 無交叉反應。

Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特為流式細胞術分析凋亡細胞的 Caspase-3 而設計。包括熒光標記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體（Anti-Active Caspase-3 FITC 或 Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜劑、破膜/沖洗緩衝液。

實驗步驟

Camptothecin 誘導細胞凋亡

在 DNA 合成中，需要拓撲異構酶 I。Camptothecin 是拓撲異構酶 I 的抑制劑，它在體外依劑量不同而影響凋亡的發生。在此，Camptothecin 做為常規的凋亡誘導方案，輔助細胞凋亡分析。

• 凋亡誘導試驗用品

用 DMSO 製備 1.0mM 的 Camptothecin 儲備液

Jurkat T 細胞（ATCC TIB-152）

• 凋亡誘導試驗步驟

1. 1×10 cells/ml 增殖的 Jurkat T 細胞加入 Camptothecin，Camptothecin 終濃度為 4-6μM。
2. 細胞 37°C 孵育 4 小時。

Active Caspase-3 染色步驟

試驗用品

1. 12×75mm 的 Falcon 管

2. PBS 緩衝液

3. 凋亡檢測試劑盒

Product

Cat. No. Size PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit

FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit

染色步驟

1. 計算抗體和 Perm/Wash Buffer 緩衝液用量：每個測試樣本加入 100μl Perm/Wash Buffer 緩衝液和 20μl 抗體（見下表）。

2. 根據用量製備 Perm/Wash Buffer（1×），將 10×濃度緩衝液使用蒸餾水進行10 倍稀釋，注意：有時 10×濃度的緩衝液內會出現沉澱，屬正常現象，在稀釋成 1×濃度的緩衝液後，使用 0.45μ的濾器過濾即可。

3. 使用冷的 PBS 緩衝液洗細胞兩次，再用 Cytofix/Cytoperm Solution 調整細胞濃度為 1×10 cells/0.5ml。

4. 細胞冰浴 20 分鐘。

5. 細胞離心，棄上清。室溫下，使用 1×Perm/Wash Buffer 洗細胞兩次，Perm/Wash Buffer 緩衝液的用量為 0.5ml Buffer/1×10 cells。

6. 按樣本數加入 1×Perm/Wash Buffer 和抗體，混勻，室溫反應 30 分鐘。

7. 每測試管中，用 1.0ml 的 1×Perm/Wash Buffer 洗細胞一次，再用 0.5ml 的 1×Perm/Wash Buffer 製成細胞懸液，在流式細胞儀上進行樣本分析。

結果分析

未經凋亡誘導的 Jurkat cells (ATCC TIB-152) (左圖)和經喜樹鹼誘導 4 小時的Jurkat cells (右圖)同時上機檢測。結果顯示如下：左圖未檢測到活化的caspase-3(左圖 M2)，右圖超過 1/3 的 caspase-3 發生了活化(右圖 M2)。證明經喜樹鹼處理，Jurkat cells 發生了明顯的凋亡。