生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/Trizol法提取總RNA

原理 編輯

Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品裂解或勻漿過程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心,樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的水樣層後,RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的形式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA,在有機層中加入異丙醇能析出有機層的蛋白。共純化DNA對於樣品間標準化RNA的產量十分有用。

Trizol試劑可用於小量樣品(50~100mg組織,5×106細胞),也可用於大量樣品(≥1g組織或≥107細胞),對人、動物、植物和細菌、血液提取都適用,可同時處理大量不同樣品。一個小時內即可完成反應,提取的總RNA沒有DNA和蛋白質污染,可用於Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護分析等。

本試劑為紅顏色,便於區分水相和有機相,同時最大限度的保持RNA的完整性。

保存條件 編輯

2~8℃避光保存12個月。

實驗前需要準備的試劑 編輯

Trizol,氯仿,異丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配製),RNase-Free水。

實驗前需要準備的物品 編輯

1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC處理過),大、中、小號槍頭(DEPC處理)

樣品前處理注意點 編輯

  1. 選擇新鮮血液,不得超過4小時。
  2. 選擇新鮮組織,生長旺盛的組織。
  3. 選擇新鮮的幼嫩組織。
  4. 選擇處於生長旺盛的時期收集細胞。

RNA純化要求 編輯

  1. 純化後不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的物質。
  2. 排除有機溶劑和金屬離子的污染。
  3. 蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降到最低程度。
  4. 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事項 編輯

  1. 杜絕外源酶的污染。
    1. 嚴格戴好口罩,手套。
    2. 實驗所涉及的離心管,Tip頭,移液器杆,電泳槽,實驗台面等要徹底處理。
    3. 實驗所涉及的試劑/溶液,尤其是水,必須確保RNase-Free。
  2. 阻止內源酶的活性。
    1. 選擇合適的勻漿方法。
    2. 選擇合適的裂解液。
    3. 控制好樣品的起始量。
  3. 明確自己的提取目的。
    1. 任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時,提取成功率急劇下降。
    2. RNA提取成功的唯一經濟的標準是後續實驗的一次成功,而不是得率。

Rnase污染的10大來源 編輯

  1. 手指頭
  2. 槍頭
  3. 水/緩衝液
  4. 實驗台面
  5. 內源Rnase
  6. RNA樣品
  7. 質粒提取
  8. RNA保存
  9. 陽離子(Ca,Mg)
  10. 後續實驗所用的酶

流程 編輯

  1. 樣品處理:
    • 培養細胞:收穫細胞1~5×107,加入1ml Trizol(異硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁邊取出白細胞即刻加入Trizol),混勻;用1ml注射器反覆抽取(約30次)以破裂細胞及剪切DNA,室溫靜置5min(使核酸蛋白複合物完全分離)。
    • 組織:取50~100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml EP管中,加入1ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5min。
  2. 可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可於2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
  3. 加入0.2ml氯仿,劇烈振盪15~30s,靜置2~3min。
  4. 4℃離心,12000g×15min。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
  5. 小心吸取上清至一新的DEPC處理過的1.5ml EP管中(如要分離DNA和蛋白質可保留有機相),加入0.5ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min。
  6. 4℃離心,12000g×10min。離心前看不出RNA沉澱,離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。
  7. 棄上清,於沉澱中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振搖,充分洗滌沉澱。
  8. 4℃離心,12000g×5min。
  9. 棄上清,短暫離心,小心吸取棄去上清。
  10. 加入適量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。
  11. 取2μl進行電泳,其餘-80℃保存。