生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/Trizol法提取總RNA

原理

Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品裂解或勻漿過程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的形式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能析出有機層的蛋白。共純化DNA對於樣品間標準化RNA的產量十分有用。

Trizol試劑可用於小量樣品（50~100mg組織，5×106細胞），也可用於大量樣品（≥1g組織或≥107細胞），對人、動物、植物和細菌、血液提取都適用，可同時處理大量不同樣品。一個小時內即可完成反應，提取的總RNA沒有DNA和蛋白質污染，可用於Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護分析等。

本試劑為紅顏色，便於區分水相和有機相，同時最大限度的保持RNA的完整性。

保存條件

2~8℃避光保存12個月。

實驗前需要準備的試劑

Trizol，氯仿，異丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配製），RNase-Free水。

實驗前需要準備的物品

1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC處理過），大、中、小號槍頭（DEPC處理）

樣品前處理注意點

1. 選擇新鮮血液，不得超過4小時。
2. 選擇新鮮組織，生長旺盛的組織。
3. 選擇新鮮的幼嫩組織。
4. 選擇處於生長旺盛的時期收集細胞。

RNA純化要求

1. 純化後不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑制作用的物質。
2. 排除有機溶劑和金屬離子的污染。
3. 蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降到最低程度。
4. 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事項

1. 杜絕外源酶的污染。
   1. 嚴格戴好口罩，手套。
   2. 實驗所涉及的離心管，Tip頭，移液器杆，電泳槽，實驗台面等要徹底處理。
   3. 實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。
2. 阻止內源酶的活性。
   1. 選擇合適的勻漿方法。
   2. 選擇合適的裂解液。
   3. 控制好樣品的起始量。
3. 明確自己的提取目的。
   1. 任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時，提取成功率急劇下降。
   2. RNA提取成功的唯一經濟的標準是後續實驗的一次成功，而不是得率。

Rnase污染的10大來源

1. 手指頭
2. 槍頭
3. 水/緩衝液
4. 實驗台面
5. 內源Rnase
6. RNA樣品
7. 質粒提取
8. RNA保存
9. 陽離子（Ca，Mg）
10. 後續實驗所用的酶

流程

1. 樣品處理：
   • 培養細胞：收穫細胞1~5×107，加入1ml Trizol（異硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁邊取出白細胞即刻加入Trizol），混勻；用1ml注射器反覆抽取（約30次）以破裂細胞及剪切DNA，室溫靜置5min（使核酸蛋白複合物完全分離）。
   • 組織：取50~100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。
2. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
3. 加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15~30s，靜置2~3min。
4. 4℃離心，12000g×15min。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
5. 小心吸取上清至一新的DEPC處理過的1.5ml EP管中（如要分離DNA和蛋白質可保留有機相），加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。
6. 4℃離心，12000g×10min。離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。
7. 棄上清，於沉澱中加入75%乙醇（冰冷）1ml，振搖，充分洗滌沉澱。
8. 4℃離心，12000g×5min。
9. 棄上清，短暫離心，小心吸取棄去上清。
10. 加入適量（20μl）DEPC （Rnase Free）H20溶解RNA（65℃促溶10~15min）。
11. 取2μl進行電泳，其餘-80℃保存。