生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/SiRNA表達載體的構建

siRNA表達載體構建可以：

1. 作為後基因組時代基因功能分析的有力工具；
2. 應用於基因組學、細胞信號傳導通路分析；
3. 用於藥物靶點篩選、疾病治療。

實驗方法原理

多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的髮夾RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以採用RNA polIII啟動子是由於它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短髮夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由於涉及到克隆 ，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。

實驗材料

目的基因

試劑、試劑盒

LB培養基

儀器、耗材

離心管、離心機、水浴鍋、漩渦振盪儀等

實驗步驟

目的基因的確定

1. 檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）。
2. NCBI查閱：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
3. 搜索引擎輔助：http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com。

設計siRNA靶序列

在製備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發現對哺乳動物細胞,最有效的siRNAs是21-23個鹼基大小、3』端有兩個突出鹼基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個鹼基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。

選擇siRNA靶位點

從轉錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3』端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始複合物可能會影響siRNP核酸內切酶複合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

序列同源性分析

將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人或者小鼠、大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.並非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應的結果,因此對於一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA。

通常來說，每個目標序列設計3-4對siRNAs，選擇最有效的進行後續研究。

設計陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的鹼基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。

表達載體的選用

1. 化學合成與體外轉錄方法都是在體外得到siRNA後再導入細胞內，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細胞後容易被降解；進入細胞siRNA在細胞內的RNAi效應持續時間短.針對這種情況，出現了質粒、病毒類載體介導的siRNA體內表達。該方法的基本思路是：將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子後，這樣就能在體內表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優點在於不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。
2. 通過質粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用Pol III啟動子的原因在於這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA，遇到4—5個連續的U即終止，非常精確。當這種帶有Pol III 啟動子和shRNA模板序列的質粒轉染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定基因的表達，可抑制外源基因和內源基因。採用質粒的優點在於，通過siRNA表達質粒的選擇標記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由於質粒可以複製擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低製備siRNA的成本。
3. 帶有抗生素標記的siRNA表達載體可用於長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質粒可以在細胞中持續抑制靶基因的表達數星期甚至更久。同時RNAi-Ready表達載體還能與逆轉錄病毒和腺病毒表達系統整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性,徹底克服某些細胞轉染效率低的障礙，是實現哺乳動物細胞siRNAs瞬時表達與穩定表 達的理想工具。

合成模板

1. 合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈後面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄中止位點，同時兩端分別設計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。
2. 95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。

連接與轉化

1. 將100 μl感受態細胞於冰上解凍。
2. 取5 μl連接產物加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內容物，在冰上放置30分鐘。
3. 將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱激90秒。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2分鐘。
4. 每管中加700 μl LB培養基，37℃振盪培養1小時，進行復甦。
5. 室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清後，用剩餘100 μl培養基重懸細胞並塗布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細胞用量應根據連接效率和感受態細胞的效率進行調整。
6. 將平板置於室溫直至液體被吸收。
7. 倒置平皿，於37℃培養，12~16小時後可出現菌落。

PCR鑑定和測序鑑定

在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側設計鑑定PCR引物，擴增片段在100-200bp之間。

注意事項

1. 從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找「AA」二連序列，並記下其3』端的19個鹼基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5』和3』端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始複合物可能會影響siRNP核酸內切酶複合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
2. 將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
3. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
4. 一個完整的siRNA實驗應該有負對照，作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計劃合成siRNA，那麼可以直接提供以AA打頭的21個鹼基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3』dTdT結尾，如果要UU結尾的話通常要特別說明。有結果顯示，UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒有區別。因為這個突出端無需和靶序列互補。

注意事項：siRNA操作成功要點

對每個基因設計並檢測兩到四個siRNA序列

為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3』端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數據庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應根據mRNA低二級結構的區域設計。

選擇低GC含量的siRNA

Ambion公司研究發現GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

純化體外轉錄siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫(Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度)或通過15-20%丙烯醯胺膠除去反應中多餘的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。

避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由於實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭髮，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除RNA酶。

健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重複性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

避免適用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染後72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。QIAGEN推出的專門針對RNA轉染的試劑

選擇好的轉染試劑轉染siRNA

針對靶細胞類型，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。siRNA實驗要求選擇適合轉小的RNA的轉染試劑(目前大多數轉染試劑都針對轉染比較大的質粒DNA，而非小的RNA分子，宿主範圍大小也不同)。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉siRNA優化的轉染試劑，是您的理想選擇。

通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA)，轉染48小時後統計對照蛋白或mRNA相對於未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。

通過陰性對照siRNA排除非特異性影響

合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。