生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/RNA干擾實驗

磷酸鈣轉染法

實驗原理

磷酸鈣沉澱法是基於磷酸鈣-DNA複合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法。磷酸鈣有利於促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA複合物粘附到細胞膜並通過胞飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可以在細胞內進行瞬時表達，也可整合到靶細胞的染色體上從而產生不同基因型和表型的穩定克隆。該方法可廣泛用於轉染許多不同類型的細胞。

儀器、材料和試劑

儀器、用具

CO₂培養箱、10cm細胞培養平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml錐形管、燒杯、量筒等。

材料

呈指數生長的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質粒DNA

試劑

完全培養液
DMEM	90ml
FCS	10ml
CaCl2，過濾除菌，-20℃保存備用	2M
2×HEBS (g/500ml)
NaCl	8.0
KCl	0.38
Na2HPO	4.7
H2O	0.19
HEPES	5.0
葡萄糖	1.0

用NaOH調pH至6.95，過濾除菌後，-20℃保存備用。

方法與步驟

• 在10cm的培養板上接種1×106個BALB/c 3T3細胞（第二天進行轉染）
• 準備CaPO4沉澱

準備兩組試管

在A管中加入	15μg質粒DNA
	69μl 2M CaCl2
	460μl重蒸水
在B管中加入	550μl 2×HEBS
用巴斯德吸管將A管中的溶液緩慢地逐滴加入在B管中，同時用另一吸管吹打B管溶液，整個過程需緩慢進行，至少需持續1～2min。
室溫靜置30min，出現細小顆粒沉澱。

• 小心地將沉澱逐滴均勻地加入培養細胞的10cm平板中，輕輕晃動（此過程需儘快完成）。
• 在5%CO2的加濕培養箱中培養細胞2-6 hr。
• 除去培養液，加入10ml完全培養液培養細胞1-6天（依具體情況而定）。
• 收集細胞進行基因活性的檢測，或分散接種到其他培養皿中進行選擇培養。

注意事項

1. 在整個轉染過程中要保持無菌操作。
2. 在實驗中使用的各種試劑都必須小心校準，保證質量。
3. 質粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉澱後的DNA應保持無菌，在無菌水或Tris- EDTA中溶解。
4. 沉澱物的大小和質量對於磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成儘可能細小的沉澱物，因為成團的DNA不能有效地黏附和進入細胞。

電穿孔和電融合技術

實驗原理

當細胞置於非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內，這一現象稱為電穿孔。運用這一技術，許多物質，包括DNA、RNA、蛋白質、藥物、抗體和熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉導方法，電穿孔已被廣泛用於各種細胞類型，包括細菌、酵母、植物和動物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質引入活細胞。與其他常用的導入外源物質的方法相比，電穿孔具有很多優點。首先，不必象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術培訓和昂貴的設備，可以一次對成百萬的細胞進行注射。第二，與用化學物質相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學副作用。第三，因為電穿孔是一種物理方法，較少依賴細胞類型，因而應用廣泛。實際上，對大多數細胞類型，用電穿孔法基因的轉移效率比化學方法高得多。

除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈衝也能引起細胞融合，這一現象叫做電融合。然而，在用電脈衝融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質融合製取雜交植物，胚胎細胞相互融合製備動物克隆方面非常有用，尤其在製取雜交瘤細胞製備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規的化學融合方法高10到100倍，最近，貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時細胞的骨架成分和細胞器的動力學重排。

儀器、材料和試劑

1. 儀器：脈衝發生器，樣品池：一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極，CO2培養箱，離心機，顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細管，離心管等。
2. 材料：
3. 試劑：

穿孔介質（PM）	15mmol/L磷酸鉀 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）　 10mmol/L HEPES　 調節pH至7.3
融合介質（FM）	1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇　 2mmol/L HEPES　 調節pH至7.3

方法與步驟

懸浮細胞的電穿孔法

電穿孔進行基因轉移

電穿孔可用於將多種不同類型的分子載入活細胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進行，只需把外源DNA換頁所需分子即可。

1. 使細胞在適宜的培養基中生長，用胰酶處理，收穫對數生長中期的細胞，並用腺酶處理。
2. 在穿孔介質（PM）中至少洗一次。洗細胞時，在台式離心機上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細胞沉降。然後，去掉上清液，在新的介質中重新懸浮細胞。
3. 計數細胞，在PM中，濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml。
4. 將DNA加到細胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
5. 在電穿孔裝置上設置輸出電壓和脈衝寬度（脈衝寬度是指數衰減函數的時間常數，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設備是CD脈衝型發生器，設定電容和並聯電阻，以達到合適的τ值。
6. 將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈衝。
7. 電處理後，向小池加1ml普通培養基，將細胞混合液從小池轉移到組織培養容器（培養皿或培養孔）中，再加入一些培養基使最終的培養基體積適量。然後，將樣品細胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。
8. 在測定轉移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養的時間不同。

檢測電穿孔效率和細胞存活率

1. 除用羅丹明偶聯葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯葡聚糖引入目標細胞的方法如前所述。
2. 電穿孔後，用培養基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
3. 電穿孔後30min，向細胞懸液中加30μl台盼藍，孵育2min，然後用培養基洗滌。
4. 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸於PM中，終體積100μl。
5. 將一滴細胞液（30μl）置於乾淨載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定攝取熒光標記葡聚糖的百分數。
6. 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了台盼藍），測定細胞存活的百分數。
7. 在各種電場設定值下重複實驗，畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數的曲線。這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的最優條件。

懸浮生長細胞的電融合

融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈衝前後，必須用低幅、高頻電場使細胞排成一條鏈。

1. 用融合介質（FM）洗懸浮細胞兩次，然後懸於FM中。洗滌細胞時，在台式離心機上1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉澱，棄去上清液將細胞懸於新鮮FM介質中。
2. 將懸浮細胞轉移到相應的融合室內。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉移前要充分混合。
3. 啟動介電電泳場，其振幅通常小於200V/cm，頻率在2MHz以內，用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈，調節振幅和頻率以達到最佳效果。
4. 讓介電電泳場開約1分鐘後關掉，立即應用融合脈衝，其振幅數量級為1kV/cm。脈衝寬度小於1ms。在進行融合脈衝後立即再次啟動介電電泳場，常規讓其開啟約2分鐘。
5. 關掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。
6. 去掉FM，用普通培養基再次洗滌細胞。
7. 將細胞轉移到培養皿，加入普通培養基，在培養箱一般條件下培養。

注意事項

最優組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優化電壓和脈衝寬度電穿孔結果仍不令人滿意，就應嘗試改變穿孔介質。

影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態有關，為達到最高效率，必須收集對數生長中期的細胞。

純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯醯胺膠除去反應中多餘的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由於實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭髮，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重複性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

避免使用抗生素

抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

選擇合適的轉染試劑

針對siRNA製備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時後統計對照蛋白或mRNA相對於未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

RNAi研究的一般技術路線