生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/MRNA的分離純化

實驗原理

真核生物的mRNA分子是單順反子，是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物，因此，高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5g RNA，理論上認為每克細胞可分離出5～10mg RNA。其中rRNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，並且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達豐度也不一樣。

真核生物mRNA有特徵性的結構，即具有5』端帽子結構（m7G）和3』端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3』端存在20~300個腺苷酸組成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結構為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標誌，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在於此。

一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3』 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩衝液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。

目前常用的mRNA的純化方法有：

1. 寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標準方法；
2. 寡聚（dT）－纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的  RNA溶液中並使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA複合物，再用洗脫液分離mRNA，然後離心除去寡聚（dT）－纖維素；
3. 其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。

本實驗應用方法（1）進行mRNA的分離純化作為示例。

試劑與器材

試劑

1. 0.1mol/L NaOH ，每組200mL
2. 寡聚Oligo（dT）-纖維素
3. 加樣/洗滌緩衝液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4. 洗滌緩衝液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒後按各成分確切含量，經混合後再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SDS至終濃度。
5. 5 mol/L NaCl，每組10mL
6. 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL
7. 無RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL
8. 70%乙醇，每組10mL

注意：溶液5，6的配製都應該加0.1% DEPC處理過夜，溶液1，3，4，8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配製，Tris應選用無RNase的級別。溶液配製後，最好能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實驗只用一份，避免多次操作造成對溶液的污染。

器材

1. 恆溫水浴箱
2. 冷凍高速離心機
3. 紫外分光光度計
4. 巴斯德吸管
5. 玻璃棉
6. 5ml一次性注射器

操作方法

oligo(dT)纖維素的預處理

1. 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2. 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理並經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3. 用3-5倍柱床洗滌緩衝液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小於8.0。
4. 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩衝液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。

總RNA濃度的調整

1. 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大於0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置於65℃水浴加熱5 分鐘，然後迅速插在冰上冷卻。
2. 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。

mRNA的分離

mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合

用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。於37℃水浴保溫並溫和搖盪15分鐘。

總RNA (mg)	寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)	洗滌緩衝液1，2 (mL)	洗脫體積(mL)
<0.2	0.2	1.0	1.0
0.2-0.5	0.5	1.5	1.5
0.5-1.0	1.0	3.0	3.0
1.0-2.0	2.0	5.0	5.0

轉移

取1個5ml的一次性注射器，取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，並把它固定在無RNase的支架上，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器，推進塞子直至底部，把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。

洗滌

根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩衝液1，溫和振盪，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時準備洗脫。

洗脫

根據上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩衝液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

測定

測定每一管的OD260，合併含有RNA的洗脫液組分於4℃，2500g，離心2-3分鐘，上清轉移至新的離心管中，去掉殘餘的oligo(dT)-纖維素。

沉澱

洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻後，-20℃30分鐘或放置過夜。

離心收集

12000g, 4℃離心15分鐘，小心棄去上清，mRNA沉澱此時往往看不見，用70%乙醇漂洗沉澱，12000g, 4℃離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉澱空氣乾燥10分鐘，或真空乾燥10分鐘。將mRNA沉澱溶於適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用於cDNA合成（或保存在70%乙醇中並貯存於-70℃）。

定量

測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率（同上一實驗）。

注意事項與提示

1. 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
2. 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質量的先決條件。
3. 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，過量的總RNA，容易造成mRNA不純。
4. RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置於65℃加熱5 分鐘，這一步很重要，其作用
   • （1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；
   • （2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱後應立即插入冰上，以免由於溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。

     

     mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖（Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker; Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA; Lane 3, 老鼠肝臟mRNA）

5. 應注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴重影響實驗結果。
6. mRNA製備後，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb範圍內（如圖）。一般來說，經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對後續實驗造成很大的影響，如果樣品充足，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。
7. 為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝後保存。另外，如果有低溫冰箱,最好在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8. 寡聚(dT)纖維素柱用後可用0.3mol/l NaOH洗淨，然後用層析柱加樣緩衝液平衡，並加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重複使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩衝液依次淋洗柱床。
9. 一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當於上柱總RNA量的1%-2%。

實驗安排

1． 第一天：試劑的配製和所用一次性塑料製品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。

2． 第二天：進行（一）、（二）和（三）1-6。

3． 第三天：進行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。

4． 為了避免由於保存時間過長造成的RNA降解，最好能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。

引物的設計一般遵循的原則

1. 典型的引物20-24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是太長的引物可能會與錯誤配對序列雜交降低了特異性，同時因為 比短序列雜交慢，從而降低了產量。
2. 設計5'端和中間區為G或C，且GC含量為50％~60％的引物，以增加引物的穩定性及其與目的序列雜交的穩定性。
3. 3'末端儘量不要富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。但因為3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，為了避免3'末端的錯誤配對，所以末端儘量避免為核苷A。
4. 在引物對3'末端儘量避免互補序列以免形成引物二聚體，抑制擴增。如果引物序列可能產生內部二級結構會破壞引物退火穩定性，也要儘量避免。
5. 此外，目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。

有時候，僅有有限的序列信息可供用於引物設計。比如，如果僅知道胺基酸序列，可以設計簡併引物，同時使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡併混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的鹼基使用偏好，減少簡併性。次黃嘌呤可以同所有的鹼基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡併鹼基，因為3'端最後3個鹼基的退火足以在錯誤位點起始PCR。