生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/RT-PCR操作步驟

逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

1. 實驗方法：逆轉錄-聚合酶鏈反應
2. 實驗材料：組織或細胞樣品
3. 試劑、試劑盒：
   • RNA提取試劑
   • dNTP 混合物
   • Taq DNA聚合酶
   • 第一鏈cDNA合成試劑盒
4. 儀器、耗材：
   • 離心管
   • 離心機
   • 水浴鍋
   • PCR管
   • 電泳儀
   • 凝膠圖像分析系統

反轉錄酶的選擇

1. Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。
2. 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。
4. MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

合成cDNA引物的選擇

1. 隨機六聚體引物：當特定mRNA由於含有使反轉錄酶終止的序列而難於拷貝其全長序列時，可採用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源於rRNA。
2. Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3』端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由於Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和複雜性方面均要小。
3. 特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3』端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

試劑準備

1. RMA提取試劑
2. 第一鏈cDNA合成試劑盒
3. dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4. Taq DNA聚合酶

操作步驟

1. 總RNA的提取：見相關內容。
2. cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
   • ① 在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。
   • ② 70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
   • 然後加入下列試劑的混合物：10×PCR buffer  2μl；25mM MgCl2  2μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT  2μl 輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。
   • ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
   • ④ 於70℃加熱15min以終止反應。
   • ⑤ 將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
3. PCR：
   • ① 取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA   2μl；上游引物（10pM） 2μl；下游引物（10pM） 2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl） 1μl。
   • ② 加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。
   • ③ 設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。
   • ④ 電泳鑑定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。
   • ⑤ 密度掃描、結果分析：採用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

注意事項

1. 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。
2. 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
3. 內參的設定：主要為了用於靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在於避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4. PCR不能進入平台期，出現平台效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對於每一個目標序列出現平台效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。
5. 防止DNA的污染：① 採用DNA酶處理RNA樣品；② 在可能的情況下，將PCR引物置於基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。