生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/質粒DNA的提取

原理

採用鹼變性發抽提取質粒DNA。該法是基於染色體DNA與質粒DNA的變性預復性的差異而達到分離目的的。在PH大於12的鹼性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH5.2的乙酸鈉高鹽緩衝液調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，保存在溶液中。而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質-SDS複合物等一起沉澱下來而被除去。

方法

1. 挑取一環在LB固體培養基平板上生長的含PUC57質粒的大腸桿菌，接在含有100μg/ml氨苄青黴素（Amp）的LB液體培養基（5ml/15ml試管）中，37℃震搖培養過夜。
2. 將1.5ml菌液加入微離心管中，14000r/min，離心10秒，其取上清液。反覆數次，收集全部菌體。
3. 傾去上清，濾紙吸乾。
4. 加30μlTE緩衝液（10mmol/L   Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0）,振盪起菌體。
5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L   Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS）,震盪10秒至溶液變粘稠。
6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震盪3—5S，14000r/min，離心3分鐘，沉澱細胞碎片及染色體DNA。
7. 上清液轉移至另一微離心管中，甲等體積胞和酚，混勻，12000r/min,離心2分鐘。
8. 上層水相轉移至另一位離心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，離心20分鐘。
9. 傾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10. 傾去乙醇，濾紙吸於，真空抽吸2～3分鐘。
11. 加人50μlTE緩衝液，溶解DNA。
12. 加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,離心2s，使核糖核酸酶與管底液體混勻。
13. 37℃水浴30min。
14. 樣品放一20℃冰箱保存備用。

試劑

• TE緩衝液(10mmol/L, Tris-HCl,1mmol/L, EDTA,pH8.0)

配製方法

Tris	1.211g
EDTA.Na	0.037g

用800ml重蒸水溶解，用分析純鹽酸調整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。

• TENS溶液：(10mmol/L, Tris-HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS)

配製方法

NaOH	0.4 g
SDS	0.5 g

加80mlTE緩衝液溶解。加TE緩衝液定容至100ml.

• 3.0mol／1醋酸鈉溶液(pH5.2)

配製方法

醋酸鈉

24.6g

用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大約調pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

• 純淨的酚使用時不需要重蒸。市售的酚一般為紅色或黃色結晶體，使用之前必須重蒸，除去能引起DNA和RNA斷裂和聚合的雜質。將苯酚置於65℃水浴中溶解，重新進行蒸餾，當溫度升至183℃時，開始收集在若干個棕色瓶中。純酚和重蒸酚都應貯存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚於分液漏斗中，加入等體積的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)緩衝液，立即加蓋，激烈振盪，並加入固體Tris搖勻調pH(一般100ml苯酚約加l克固體Tris)分層後測上層水相pH至7.6一8.0。從分液漏斗中放出下層酚相於棕色瓶中，並加一定體積0.1mol／L Tris-HCI(pH8.0)覆蓋在酚相上，置4℃冰箱貯存備用。酚是一種強腐蝕劑，能引起腐蝕性損傷，操作時應戴上眼鏡和手套。如果皮膚上濺上了酚，應用大量水沖洗或用肥皂水沖洗。酚在空氣極易氧化變紅，要隨時加蓋，也可加入抗氧化劑0.1％β-羥基喹啉及0.2％β-巰基乙醇。
• 無水乙醇：置-20℃冰箱中保存備用
• 70％乙醇：置-20℃冰箱中保存備用
• 核糖核酸酶(10mg／ml)配製方法：稱取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美國SIGMA或中科院上海生物化學研究所東風試劑廠)。於滅菌的微離心管內，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即為10mg／ml RNase，為了破壞脫氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然後置一20℃(或家用冰箱的冰格內)保存。『

材料

菌種：大腸桿菌(pUC57)

LB液體培養基

精解蛋白腖	3g
酵母浸出粉	1.5g
氯化鈉	3g
葡萄糖	0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH調pH至7.2～7.4。分裝於15ml試管中，每支5ml。然後置高壓蒸汽消毒鍋以1.1kg／cm2滅菌20min.

抗菌素：氨苄青黴素(Amp)臨用時用無菌水配製在無菌有蓋試管中，濃度為100mg／m1。

儀器

恆溫振盪器。

低溫冰箱-20℃

真空泵。

台式高速離心機

注意事項

1. 質粒DNA提取的方法很多，有鹼變性法、羥基磷灰石柱層析法、溴化乙錠一氯化銫梯度超離心法等。本次實驗是一種小量快速提取法。小量快速提取法也有多種，但基本原理和步驟是一致的．包括下述步驟：
   • 裂解菌體細胞；
   • 質粒和染色體DNA的分離；
   • 除去蛋白質。RNA及其他影響限制性酶活性的細胞成分；
   • 除去提璣過程中使用的去垢劑、鹽等。
2. 在基因操作實驗中．保存或提取DNA過程中，一般都採用TE緩衝液，而不選用其它的緩衝液。雖然很多緩衝系統．如磷酸鹽緩衝系統，硼酸系統都符合細胞內環境的生理範圍，可以作為DNA的保存液，但在某些實驗中，這些緩衝對會影響實驗。如在轉化實驗中，要用到Ca+，如果川磷酸鹽緩衝液，磷酸根將與Ca2+產生Ca(PO4+沉澱；在各種工具酶反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高鹽離子濃度，有的則要求低鹽濃度，採用Tris—HCI緩衝系統，不存在金屬離子的干擾作用；作中的EDTA是二價離子Mg2+、Ca2+等的螯合劑，可降低系統中的這些離子濃度，而這些離產是脫氧核糖核酸酶的輔助因子，所以EDTA可以抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用。
3. TENS中NaOH：核酸在pH大於5,小於9的溶液中穩定，怛當pH大於12或小於3時，就會引起DNA兩條鏈之間氫鍵的解離而變性。TENS中有NaOH使其pH大於12，因而使染色體DNA與質粒DNA變性。TENS中的SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：
   • 溶解細胞膜上的脂肪與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜；
   • 解聚細胞中的核蛋白；
   • SDS能與蛋白質結合成為R1一O一SO3…R2+一蛋白質的複合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去乾淨，防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA時)受干擾。
4. 3.0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大於12的DNA抽提液回到中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。染色體DNA不能復性(染色體DNA不存在超螺旋共價閉合環結構)  而高鹽的3mol/L  NaAC有利於變性的大分子染色體DNA、RNA、以及SDS—蛋白質複合物凝聚沉澱。pH5.2也能中和核酸上的電荷，減少相互斥力而互相聚合。同時，鈉鹽能與SDS一蛋白質複合物作用後，形成溶解度較小的鈉鹽形式複合物，使沉澱更完全。
5. 飽和酚：酚是一種表面變性劑，屬非極性分子。水是極性分子。當蛋白質溶液與酚混合合時，蛋白質分子之間的水分子被酚擠走，使蛋白質失去水合狀態而變性。經過離心。變性蛋白質的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，酚比重更大，保留在最下層。酚作為變性劑．也有一些缺點：
   • 酚與水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可達大約10％～15％，溶解在這部分水相中有DNA會損失，
   • 酚很容易氧化，變成粉紅色，氧化的酚容易降解DNA，解決酚氧化和帶水的辦法是將酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris—HCl緩衝液飽和，使酚不至於奪去DNA中的水，帶走部分DNA。
   • 飽和酚中加上8一羥基硅啉及巰基乙醇，防止酚氧化，還是弱的螫合劑．可抑制DNase。由於有顏色．溶解在酚中後，使酚帶上顏色，便於酚相與水相的分肉，酚飽和後，表面蓋上一層Tris水溶液，隔絕空氣，阻止酚氧化。
6. 關於無水乙醇沉澱DNA的說明：用無水乙醇沉澱DNA，是實驗中最常用的沉澱DNA的方法。乙醇的優點是具有極性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇與核酸不會起化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉澱劑。
   • 乙醇之所以能沉澱DNA，是由於DNA溶液是以水合狀態穩定存在的DNA，當加入乙醇．乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合沉澱，一般實驗中，用2倍體積的無水乙醇與DNA相混合。使乙醇的最終含量占67％左右。由此可預見，也可用95％乙醇沉澱DNA，但是用95％乙醇使總體積增大．而DNA在醇溶液中總有一定程度的溶解。因而DNA損失也增大，影響收率。
   • 乙醇沉澱DNA溶液時，DNA溶液中應該有一定的鹽濃度，中和DNA表面電荷。如果溶液中鹽濃度太低，要加NaAC或NaCl至最終濃度0.1~0.25mol／l在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子帶負電荷，加一定濃度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易於互相聚合而形成DNA鈉鹽沉澱。當加入的鹽溶液濃度太低時。只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉澱不完全。但當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好，在沉澱的DNA中，由於過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須進行洗滌或重沉澱。
   • 乙醇沉澱DNA一般採用低溫條件，這是由於在低溫條件下．分子運動大大減少，DNA易於聚合而沉澱。為了使質粒DNA能充分沉澱，一般保存時間總是過長的，同時也要視樣品的體積而異，在微量離心管中的樣品要比40毫升離心管中DNA樣品的量少，冷卻就較迅速。

大量提取DNA時，目前習慣上常採用如下幾種方法：

保存在家用冰箱結冰盒內	過夜
保存在-2℃亡冰箱內	過夜
保存在-70℃冰箱內	30mm～2h
放置乾冰中（約-20℃）	30min
放置乾冰加酒精中(約-70℃)	16mm
放置在液氮缸中液氮的氣相內，不可以浸在液氮中(溫度在-198℃左右)	5～15min

除了用乙醇外還可用1倍體積丙醇(相當於2倍體積乙醇)使DNA沉澱。用異丙醇的好處是要求離心的液體體積小，但異丙醇揮發性不如乙醇，最終除區其殘留部分的難度更大。

此外，異丙醇能促使蔗糖、氯化鈉等溶質與DNA一起沉澱，在-70℃時，更易發生，所以一般以乙醇沉澱為宜，除非要求液體體積很小。

影響質粒DNA提純質量和產率因素的說明

菌株

質粒的宿主菌菌株的不同對質粒DNA純化的質量和產率很大。一般最好選用enA基因突變的宿主菌，即enA-菌株，如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野生型enA基因的菌株會影響質粒DNA的純度。

A基因是核酸內切酶I。核酸內切酶I是一種12kDa的壁膜蛋白，受鎂離子激活，可被EDTA抑制，對熱敏感。雙鏈DNA是核酸內切酶I的底物，但RNA是該酶的競爭性抑制劑．能改變酶的特異性，使其由水解產生7個鹼基的寡聚核苷酸的雙鏈DNA內切酶活性，變為平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸內切酶I的功能仍不清楚，enA基因突變的菌株沒有明顯的表現改變，但質粒產量及穩定性明顯提高。細菌不同生長期核酸內切酶I的表達水平不同。生長的指數期較穩定期核酸內切酶I水平高300倍。此外，培養基中促進快速生長的成分如高葡萄糖水及補充胺基酸都會使核酸內切酶I水平增高。

此外，菌株的其他性質有時也應加以考慮。如XL1—Blue生長速度較慢。,HBl01及其衍生菌株如TG1及JMl00序列，含大量的糖，這些糖如果在質粒純化過程中不除去，在菌體裂解後釋放出來，可能抑制酶活性。

質粒的拷貝數

細菌中質粒的拷貝數是影響質粒產量的最主要的因素。質粒的拷貝數主要由複製起點(replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列決定。這些被稱作複製點的區域通過細菌的酶複合物控制質粒DNA的複製。當插進一些特殊的載體時，能降低質粒的拷貝數。此外，太大的DNA插入也能使質粒拷貝數下降。一些質粒，如pUC序列，由於經過了突變和改造，在細菌細胞內的拷貝數很大．以pBR322質粒為基礎的質粒拷貝數較低，粘粒(cosmid)及特別大的質粒通常拷貝數極低。

各種質粒和粘粒的複製起點和拷貝數

	載體	複製起點	拷貝數	特點
質粒	pUC 載體	ColE1	500～700	高拷貝
	pBluescript 載體	ColE1	300～500	高拷貝
	pGEM 載體	pMB1	300～400	高拷貝
	pTZ 載體	pMB1	>1000	高拷貝
	pBR322 及其衍生質粒	pMB1	15～20	低拷貝
	pACYC 及其衍生質粒	p15A	10～12	低拷貝
	psc101 及其衍生質粒	psc101	～5	極低拷貝
粘粒	SuperCos	ColE1	10～20	低拷貝
	PWE15	ColE1	10～20	低拷貝

細菌培養

用於製備質粒的細菌培養應該從選擇性培養的平板中挑取單個菌落培養。不應該直接從甘油保存菌，半固體培養基及液體培養基中挑菌，這可能導致質粒丟失。也不該從長期保存的平板上直接挑菌，這也可能使質粒突變或使質粒丟失。挑取單個菌落至3ml選擇性培養基中，培養至飽和狀態(12～14小時)就可進行小量質粒提取。

試劑盒提取方法

除了本實驗採用的小量質粒DNA提取法外，很多生物試劑公司還提供試劑盒用於小量質粒DNA的提取。通常情況下．採用試劑盒都能獲得較高質量的DNA，所得到的DNA都可直接用於傳染、測序及限制酶分析等。下面介紹三種試劑盒。

用Bio-Rad質粒小量製備試劑盒提取質粒DNA

1. 取過夜培養的菌液l～2ml至微離心管中。離心30s沉澱細胞，吸去所有上清。
2. 加200μl細胞懸浮液(Cell Rcsuspension Solution) 並吹打數次(或旋渦振盪)，使沉澱完全懸浮。
3. 加250μl細胞裂解液(Cell Lysis Solution)，輕輕顛倒管l0次(不旋渦振盪)如果細胞裂解了，溶液應變得粘稠且稍清亮。如果仍然渾濁，繼續混合。
4. 加250μl中和液(Neuralization Solution)，輕輕顛倒管10次(不旋渦振盪)混合(此時應該形成可見沉澱)。
5. 在微離心機上以最高轉速(12 000～14 000g)沉澱細胞碎片5min。在管底或沿着管壁有緊密白色沉澱。
6. 將一支過濾柱(Spin Filter)插在一支新離心管上。
7. 直接吸200μl基質懸液(Quantum Prep Matrix)到含白色沉澱的管中(吸基質中成份前，徹底混合基質)，為避免管壁有沉澱，吹吸2次混合，立即直接將懸液倒在過濾柱(Spin Filter)內，當所有樣品轉移到過濾柱內後，離心30s。
8. 從微離心管上移開過濾柱，棄去離心管底的濾液。
9. 再放過濾柱到同一管上。加500μl洗滌液(Wash Solution)洗滌基質(第一次使用前加63ml 95％乙醇到洗滌液中)，離心30s。
10. 從微離心管上移開過濾柱，棄去離心管底的濾液，再放過濾柱到同一管上。
11. 加500μl洗滌液洗滌基質，離心2nun，除去殘存的乙醇。移開過濾柱，棄去離心管。
12. 放過濾柱在一新離心管上，加100μl去離子水或TE，離心30s洗脫DNA。棄去過濾柱，將洗脫的DNA保存在-20℃。

用泛特津公司的日常型質粒DNA小量製備試劑盒提取質粒DNA

1. 取5ml過夜培養的菌液，用台式離心機最高速度離心lmin，棄盡上清。
2. 加入250μlS1溶液懸浮細菌，加入250山S2溶液，混和但充分地上下混合均勻3～4次。
3. 加400μl 4℃預冷的S3溶液，溫和但充分地上下混合均勻．靜置2min。
4. 將溶液連同凝結塊一起轉入到微量濾器中，1000r／min離心30s，使溶液直接過濾到2ml離心管中。
5. 將過濾液從2ml離心管中轉入到DNA小量製備管中，3600r／min離心lmin。
6. 棄2ml離心管中溶液．將DNA小量製備管重新置回到2ml離心管中。
7. 加500μl W1溶液，3600r／min離心1min，棄2ml離心管中溶液，將DNA小量製備管重新置回到2ml離心管中。
8. 加650μl S5溶液，3600r／min離心lmin。
9. 將DNA製備管移人另一2ml離心管中，再加650μl S5溶液，1200r／min離心2min。
10. 將小量製備管移到1.5ml離心管上，加60μl 65℃預熱的TE緩衝液於DNA結合膜中間，室溫下置lmin，1200r／min,離心1min,洗脫質粒DNA。

用Qiegan質粒DNA小量製備試劑盒(P1asmid Mini Kit)提取質粒DNA

試劑盒組成

質粒提取試劑盒(Plasmid Kits)	小量25次（Mini 25）	小量100次（mini 100）
廠家目錄號(Catalog No.)	12123	12125
純化柱(QIAGEN—tip 20)	25	100
Pl緩衝液(Buffer，P1)	20ml	40ml
P2緩衝液(Buffer，P2)	20ml	40ml
P3緩衝液(Buffer, P3)	20ml	40ml
QBT緩衝液(Buffer QBT)	40ml	110ml
QC緩衝液(Buffer QC)	120ml	480ml
QF緩衝液(Buffer QF)	30ml	110ml
RNase A(100mg／ml)	2mg	4mg
使用手冊(Handbook)	1	1

實驗步驟

1. 取3nd過夜培養的菌液，用台式離心機最高速度離心,棄去上清。沉澱用0.3ml含Rnase A的P1緩衝液(Buffer P1)溶解。註：P1緩衝液在使用前應該加人試劑盒中提供的RNase A溶液．Rnase A溶液加入P1緩衝液前．可先短時高速離心至管底。含Rnase A的P1緩衝液可於2～8℃保存6個月．
2. 加0.3m1 P2緩衝液(Buffer P2)，輕輕顛倒管4～6次混勻(不要旋渦振盪)，室溫放
3. 置5 min。註：裂解反應時間不要大干5 min。P2緩衝液開蓋取完試劑後．立即重新；旋上蓋子．以免試劑中的NaOH與空氣中的CO2反應。
4. 加0.3ml預冷的P3緩衝液(Buffer P3)，立即輕輕顛倒管
5. 再次混勻樣品，在台式離心機上以最大轉速(10 000—13 0OOr/ min或14 000～18 000r/ min)離心10 min，移出上清，註：離心後，上清應該時清亮的．如果上清不清亮，再次離心至上清清亮，不清亮的成分將堵塞柱子，使流速清亮。
6. 用lml QBT緩衝液(Buffer QBT)平衡QIAGEN—tip 20，讓補上液體自然(以重力)流干。
7. 向QIAGEN-tip 20柱上加入步4收集的上清，讓上清自然(以重力)流人柱中。上清儘快加人到柱中．如果存放時間太久．由於蛋白質沉澱變混，上樣前應重新離心，以免堵塞柱
8. 用4 X 1ml，緩衝液(Buffer QC)洗滌QIAGEN—tip 20柱。    『
9. 用O.8ml緩衝液(Buffer QF)洗脫DNA。
10. 用0.7體積(0.8ml 洗脫流出液則為0.56ml)室溫放置的異丙醇沉澱離心機上≥10 000r／min離心30 min，小心倒出上清。
11. 用1ml 70％乙醇洗滌DNA，空氣乾燥5 min，以適當體積緩衝液重新溶解DNA。

試劑

1. P1緩衝液(菌體重懸緩衝液)：50mmol／l Tris-HCl，pH8.0;10mmol／L EDTA；100／μg／ml RnaseA 4℃保存。
   • 配製方法：Tris 6.06 g，EDTA·2H2O 3.72 g，用800ml ddH2O溶解，用HCl調pH至8.0加ddH2O至1000 ml。1000 ml P1緩衝液中加入100 mg RNaseA。
2. P2緩衝液(裂解緩衝液)：200mmol／L NaOH，1％SDS。室溫保存。
   • 配製方法：NaOH 8.0g溶於950ml ddH2O中，加入50 ml 20%SDS溶液加ddH2O至1000 ml。
3. P3緩衝液(中和緩衝液)：3.0mmo]／L乙酸鉀，pH5．5。室溫或4℃保存
   • 配製方法：乙酸鉀294.5g溶於500 ml ddH3O中，用冰乙酸(約110m1)調pH至5.5 加ddH2O至1000 ml。
4. QBT緩衝液(平衡緩衝液)：750mmol／L NaCl; 50mmol／L MOPS，pH7.O;15％異丙醇；0.15％Triton X—100。室溫保存。
   • 配製方法：NaCl 43.83g，MOPS(自由酸)10.46g溶於860ml ddH2O。調pH至7.0。加150 ml純異丙醇及15 ml lO％ TritonX—100溶液，加ddH2O至1000ml。
5. QC緩衝液(沖洗緩衝液)：1.0mmol／L NaCl；50mmol／L MOPS，pH7.0；15％異丙醇。室溫保存。  
   • 配製方法：NaCl 58.44g；MOPS(自由酸)10.46g溶於800 ml ddH2O 。調pH7.0。加150ml純異丙醇，加ddH2O至1000ml。
6. QF緩衝液(洗脫緩衝液)：1.25mol／L NaCl；50mmol／L Tris HCl，pH8.5；15％異丙醇。室溫保存。
   • 配製方法：NaCl 73．05g，Tris 6．06g，溶於800ml ddH2O。用HCl凋pH至8.5。加150ml純異丙醇，加ddH2O至1000ml。
7. TE：10mmol／L Tris-HCl，pH8.O，1mmol／L EDTA。室溫保存。
8. STE：100mmol／L NaCl，10mmol／L Tris-HCl，pH8.0，1mmol／L EDTA。室溫保存。
   • 配製方法：NaCl 5.84g，Tris 1.21g，EDTA·2H2O 0.37g，溶於800ml ddH20中，用HCl調pH8.0，加ddH2O至1000ml。