生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/單核苷酸多態性（SNP）實驗

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態性，是由於單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態性(Polymorphism)。據估計，在人類基因組中，大約每千個鹼基中有一個SNP，無論是比較於度多態性(RFLP)分析還是微衛星標記(STR)，都要廣泛得多。

實驗方法原理

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態性，是由於單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態性(Polymorphism)。據估計，在人類基因組中，大約每千個鹼基中有一個SNP，無論是比較於限制性片段長度多態性(RFLP)分析還是微衛星標記(STR)，都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的最小單位,據估計，人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。一般認為，相鄰的SNPs傾向於一起遺傳給後代。於是，我們把位於染色體上某一區域的一組相關聯的SNP等位位點稱作單體型（haplotype）。大多數染色體區域只有少數幾個常見的單體型（每個具有至少5%的頻率），它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態性。一個染色體區域可以有很多SNP位點，但是我們一旦掌握了這個區域的單體型，就可以只使用少數幾個標籤SNPs(tagSNP)來進行基因分型，獲取大部分的遺傳多態模式。

實驗材料

組織樣品
試劑、試劑盒：液氮、PBS、GA緩衝液、GB緩衝液、蛋白酶K、無水乙醇、蛋白液、漂洗液等
儀器、耗材：離心管、離心機、廢液收集管、吸附柱、水浴鍋、分光光度計、低溫冰箱等

實驗步驟

DNA抽提

取新鮮肌肉組織約100 mg，PBS漂洗乾淨，置於1.5 ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
加200 μl 緩衝液GA，震盪至徹底懸浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混勻。
加220 μl 緩衝液GB，充分混勻，37℃消化過夜，溶液變清亮。加220 μl 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉澱。
將上述一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
加入500 μl 去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
加入700 μl 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心2 分鐘，儘量除去漂洗液。
將吸附柱CB 轉入一個乾淨的離心管中，加入100 μl 洗脫緩衝液（洗脫緩衝液應在60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩衝液50 μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。
採用Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD260/280 的值應為為1.7-1.9。
從原液中取出相應體積DNA 溶液，稀釋致50 ng/ul，原液置於-70℃保存，稀釋液置於-20℃保存。

PCR擴增目的片段

按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系，典型的PCR反應體系如下（20 ul體系）
向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管於儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。

PCR反應體系
10x Buffer	2 μl
Taq酶	1 μl
dNTP	0.5 μl
上游引物	0.5 μl
下游引物	0.5 μl
無菌水	14.5 μl
DNA模版	1 μl

在T1型PCR儀上編輯一個程序

1. 按[C programs]進入編輯模式。要在主目錄中創建一個程序請按[D enter]。要進入一個子目錄，用→鍵將光標向右移動，然後用↑↓鍵選擇一個子目錄。按[D enter]進入選擇的子目錄。

2. 輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時間，用小數點來間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認時間設置，或者用光標鍵移動到下一個區域。＃表示循環的次數。設定循環值=總循環值-1，即，總循環數為30時應輸入「29」。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序。程序數據永久的儲存在記憶中。

四、運行程序

按[B start/stop]選擇一個程序。用→↑↓鍵選擇一個子目錄，或者用[D enter]進入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動程序。

五、控制測試過程

運行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩餘的時間信息。運行完成後，按STOP按鈕終止實驗，按YES確認終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關閉電源，本次實驗結束。

六、PCR產物測序

由專門負責測序的服務公司完成。

七、數據分析

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發現的SNP在基因組中的位置：重點是啟動子區、外顯子區域（包括編碼區的cSNP及5』及3』UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導致胺基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。

注意事項

為保證待測目的區域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50 bp；
引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；
為保證測序敏感性，PCR產物片段大小應在250 bp－650 bp範圍；
為方便實驗，建議引物合成時分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開；
為保證引物的特異性，建議引物設計後在NCBI上blast確認；
為防止降解，PCR產物應儘快測序，否則應該保存在-20℃，且時間不宜過長；
為保證結果真實性，建議對關鍵點進行反向測序確認。