生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/等電聚焦電泳法測定蛋白質的等電點

實驗原理

等電聚焦（Isoelectric focusing，簡稱IEF）是六十年代中期出現的新技術。近年來等電聚焦技術有了新的進展，已迅速發展成為一門成熟的近代生化實驗技術。目前等電聚焦技術已可以分辨等電點（pI）只差0.001pH單位的生物分子。由於其分辨力高，重複性好，樣品容量大，操作簡便迅速，在生物化學、分子生物學及臨床醫學研究中得到廣泛的應用。

蛋白質分子是典型的兩性電解質分子。它在大於其等電點的pH環境中解離成帶負電荷的陰離子，向電場的正極泳動，在小於其等電點的pH環境中解離成帶正電荷的陽離子，向電場的負極泳動。這種泳動只有在等於其等電點的pH環境中，即蛋白質所帶的淨電荷為零時才能停止。如果在一個有pH梯度的環境中，對各種不同等電點的蛋白質混合樣品進行電泳，則在電場作用下，不管這些蛋白質分子的原始分布如何，各種蛋白質分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度中相對應的位置處進行聚焦，經過一定時間的電泳以後，不同等電點的蛋白質分子便分別聚焦於不同的位置 。這種按等電點的大小，生物分子在pH梯度的某一相應位置上進行聚焦的行為就稱為「等電聚焦」。等電聚焦的特點就在於它利用了一種稱為兩性電解質載體的物質在電場中構成連續的pH梯度，使蛋白質或其他具有兩性電解質性質的樣品進行聚焦，從而達到分離、測定和鑑定的目的。

兩性電解質載體，實際上是許多異構和同系物的混合物，它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之間。常用的進口兩性電解質為瑞典Pharmacia-LKB公司生產的Ampholine和Pharmalyte，價格昂貴。國產的有中國軍事醫學科學院放射醫學研究所和上海生化所生產的兩性電解質，價格便宜，質量尚佳。兩性電解質在直流電場的作用下，能形成一個從正極到負極的pH值逐漸升高的平滑連續的pH梯度。若不同的pH值的兩性電解質的含量與pI值的分布越均勻，則pH梯度的線性就越好。對Ampholine兩性電解質的要求是緩衝能力強，有良好的導電性，分子量要小，不干擾被分析的樣品等。

在聚焦過程中和聚焦結束取消了外加電場後，如保持pH梯度的穩定是極為重要的。為了防止擴散，穩定pH梯度，就必須加入一種抗對流和擴散的支持介質，最常用的這種支持介質就是聚丙烯醯胺凝膠。當進行聚丙烯醯胺凝膠等電聚焦電泳時，凝膠柱內即產生pH梯度，當蛋白質樣品電泳到凝膠柱內某一部位，而此部位的pH值正好等於該蛋白質的等電點時，該蛋白質即聚焦形成一條區帶，只要測出此區帶所處部位的pH值，即為其等電點。電泳時間越長，蛋白質聚焦的區帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率。這是等電聚焦的一大優點，不像一般的其他電泳，電泳時間過長則區帶擴散。所以等電聚焦電泳法不僅可以測定等電點，而且能將不同等電點的混合的生物大分子進行分離和鑑定。

早期的等電聚焦電泳是垂直管式的，其特點是體系是封閉的，不與空氣接觸，可防止樣品氧化。近年來，又發展了超薄層水平板式等電聚焦電泳。此法的優點是加樣數量多，節省兩性電解質，電泳後固定、染色、乾燥都十分迅速簡便，其最大優點是防止了電極液的電滲作用而引起正負兩極pH梯度的漂變。

測定pH梯度的方法有四種：

1. 將膠條切成小塊，用水浸泡後，用精密pH試紙或進口的細長pH複合電極測定pH值，然後作圖。
2. 用表面pH微電極直接測定膠條各部分的pH值，然後作圖。
3. 用一套已知不同的pI值的蛋白質作為標準，測定pH梯度的標準曲線。
4. 將膠條於－70℃冰凍後切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微電極測其pH。

儀器和用具

1. 電泳儀
2. 垂直管式園盤電泳槽一套
3. 注射器與針頭
4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml
5. 小燒杯若干
6. 培養皿一套
7. 直尺
8. 小刀
9. 精密pH試紙和帶細長複合pH電極的pH計
10. 塑料薄膜和橡皮筋

試劑

1. 丙烯醯胺
2. 甲叉雙丙烯醯胺
3. 兩性電解質Ampholine（40%，pH3.5~9.5）
4. 過硫酸胺（催化劑）
5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速劑）
6. 磷酸
7. NaOH
8. 三氯乙酸（TCA）

溶液配製

1. 丙烯醯胺貯液（30%丙烯醯胺，交聯度2.6%）：，30g丙烯醯胺和0.8g甲叉雙丙烯醯胺溶於H2O，定容至100ml，濾去不溶物後存於棕色瓶，4℃可保存數月。（全班公用）（另一配方為29.1g 丙烯醯胺和0.9g 甲叉雙丙烯醯胺溶於H2O，定容至100ml，交聯度為3.0%）。
2. 兩性電解質Amphline（40%）的加入量為：50μl /ml 膠液。
3. 過硫酸胺：配成1mg/ml的濃度，當天配製，配100ml全班公用。膠液中的加入量為0.5mg/ml膠液。
4. TEMED：膠液中的加入量為1μl/ml膠液。
5. 蛋白質樣品：選用兩種等電點相差較大的蛋白質，每根垂直管中每種蛋白質的加樣量控制在<100μg。蛋白質樣品配製成各為5mg/ml的濃度。配2.5ml全班公用。
6. 固定液：10%的三氯乙酸，每組配50ml。
7. 陽極電極液：0.1M H3PO4
   • 3.4ml 濃磷酸（85%）加H2O至500ml，每個電泳槽用500ml。
8. 陰極電極液：0.5M NaOH
   • 2g NaOH 加H2O溶解至500ml，每個電泳槽用500ml。

操作步驟

配膠

膠濃度	5.0%	4.8%	5.0%
膠液總體積	8ml	10ml	12ml
丙烯醯胺貯液	1.33ml	1.60ml	2.0ml
Ampholine	0.40ml	0.50ml	0.60ml
TEMED	0.008ml	0.010ml	0.012ml
蛋白質樣品	0.080ml	0.100ml	0.120ml
H2O	2.26ml	2.79ml	3.27ml
過硫酸銨(1mg/ml)	4.0ml	5.0ml	6.0ml
裝管數	4支	5支	6支

過硫酸銨是膠聚合的催化劑，因此最後加入，加畢，立即搖勻，因膠很快就會聚合，必須立即裝管。通常化學聚合的膠液，需在過硫酸銨加入前進行減壓抽氣處理，本實驗將此抽氣步驟省略並不影響實驗結果。

裝管

每個學生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然後將圓盤電泳槽的玻璃管洗淨，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內，（每根玻璃管的容量約為1.5~1.8ml）,液面加至距管口1mm處，用注射器輕輕加入少許H2O，進行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時可觀察到水封下的折光面。

裝槽和電泳

用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內，調節好各管的高度，記下管號。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負極，開啟電泳儀，恆壓160V，聚焦2至3小時，至電流近於零不再降低時，停止電泳。

剝膠    

取下膠管，用H2O 將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉動膠管和內插針頭的同時分別向膠管兩端注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置於小培養皿內，記住正極端為「頭」，負極端為「尾」，若分不清時，可用pH試紙鑑定，酸性端為正，鹼性端為負。

固定

取2支膠條置於一個小培養皿內，倒入10%三氯乙酸溶液至沒過膠條，進行固定，約半小時後，即可看到膠條內蛋白質的白色沉澱帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長度「L2」和正極端到蛋白質白色沉澱帶中心（即聚焦部位）的長度「L』」。

固定後的膠條可在康強860紫外/可見分光光度計上用280nm或238nm波長作凝膠掃描，然後用掃描圖作相應的測量和計算。

測定pH梯度

將放在另一個培養皿內未固定的膠條，用直尺量出待測pH膠條的長度「L1」。按照由正極至負極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長的小段，分別置於小試管中，加入1ml H2O，浸泡半小時以上或過夜，用仔細校正後的帶細長pH複合電極的pH計測出每管浸出液的pH值。

數據處理

• 以膠條長度（mm）為橫座標，pH值為縱座標作圖，得到一條pH梯度曲線。所測每管的pH值為10mm膠條的pH的混合平均值。作圖時將此pH值取為10mm小段中心即5mm處的pH值。

• 用下式計算蛋白質聚焦部位至膠條正極端的實際長度L ：

 $L=L'\times {L_{1} \over L_{2}}$

上式中：  L』——量出蛋白質的白色沉澱帶中心至膠條正極端的長度。

              L1——測pH的膠條的長度

              L2——固定後膠條的長度

• 根據計算出的L，由pH梯度曲線上查出相應的pH值，即為該蛋白質的等電點。

• 畫出固定後所測膠條的示意圖。

附註

對兩性電解質的要求

兩性電解質是等電聚焦的關鍵試劑，所以對兩性電解質的質和量都要特別注意。兩性電解質含量以2%～3%較適合，能形成好的pH梯度。由於載體兩性電解質是由多乙烯多胺與丙烯酸進行加成反應生成的混合物，防止時間過長會分菌，分解變質，不能使用。

指教注意的問題

1. 丙烯醯胺最好是重結晶的。
2. 過硫酸銨一定要新配製。
3. 所有水要用雙蒸水。
4. 制膠時，玻璃板和模板必須水平放置。
5. 模板要平直光滑，不然灌膠時易濺漏。

防止燒膠

1. 平板等點聚焦電泳的膠很薄（0.6mm），當穩流在8mA時，電壓可上升到550V以上，由於陰極飄移，造成局部電流過大，膠承受不了而被燒斷。
2. 防止燒膠的辦法：注意觀察，穩流8mA，電壓上升到550V時，立即關電源。用恆功率電泳儀，控制輸出功率在指定範圍。在一定功率範圍內，改進冷卻條件，使因電流產生的熱量及時散去。
3. 如果膠被燒了，可在燒斷的位置換上一條寬的電極條壓過斷縫或在電源電極條內側加一電極條，以此補救。

攪拌製作注意事項

固定液可使蛋白質變性，不再擴散，故一定要多換一次；在電泳後取膠、固定、染色直至制干膠板都必須仔細，防止膠被損壞。